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Recientemente, Dong Chunyang, graduado directo de doctorado de la Universidad de California, Davis, y actualmente involucrado en una investigación postdoctoral en la Universidad de Stanford, desarrollaron conjuntamente una nueva sonda fluorescente codificada genéticamente, que proporciona una herramienta innovadora para el estudio de la dinámica de los neuropéptidos.

Imagen | Dong Chunyang (Fuente: Dong Chunyang)

Según los informes,La idea central de este estudio es fusionar proteínas fluorescentes con receptores opioides y reflejar el proceso de unión de los péptidos opioides en tiempo real a través de cambios en las señales de fluorescencia provocados por cambios en la conformación del receptor.

Durante este período, Dong Chunyang y otros diseñaron las sondas fluorescentes correspondientes κLight, δLight y μLight respectivamente para los tres principales subtipos de receptores de opioides: el receptor κ, el receptor δ y el receptor μ.

De esta manera, no sólo se pueden distinguir diferentes tipos de péptidos opioides, sino que también se puede lograr una detección de señales con alta resolución espaciotemporal a nivel de una sola célula.

(Fuente: Neurociencia de la naturaleza)

Mediante el desarrollo y la aplicación de nuevas sondas fluorescentes, este estudio tiene como objetivo explorar en profundidad las funciones y los mecanismos reguladores del sistema de péptidos opioides desde múltiples niveles.

Esto no sólo ayudará a las personas a comprender el papel del sistema opioide en el comportamiento emocional y motivacional, sino que también puede proporcionar nuevos conocimientos para comprender y tratar las enfermedades mentales relacionadas.

Al estudiar las interacciones receptor-ligando a nivel molecular, la señalización a nivel celular y de circuito, y la regulación funcional a nivel conductual general, se espera que este logro suponga un progreso revolucionario en el estudio del sistema opioide.

Supone un paso importante hacia una mejor comprensión del sistema opioide endógeno y proporciona una nueva herramienta valiosa para el estudio del sistema de péptidos opioides.

Las sondas para opioides endógenos y sintéticos son una gran adición a la “caja de herramientas” actual de la neurociencia y pueden conducir a un mejor muestreo espaciotemporal de la señalización de los opioides.

Esto no sólo promoverá el desarrollo de la investigación básica en neurociencia, sino que también abrirá nuevas perspectivas para aplicaciones clínicas como el tratamiento del dolor y las adicciones.

(Fuente: Neurociencia de la naturaleza)

Empecemos por el “estado” de los neuropéptidos opioides

Según los informes, en el campo de la neurociencia, el sistema de neuropéptidos opioides ocupa una posición central.

Como sustancia neuromoduladora clave, los péptidos opioides desempeñan un papel indispensable en la regulación de múltiples procesos fisiológicos y patológicos, como la percepción del dolor, la conducta de recompensa, la respuesta emocional y la adicción.

Sin embargo, la investigación en profundidad sobre el sistema de péptidos opioides endógenos se ha visto limitada por medios técnicos durante mucho tiempo.

Aunque los métodos de investigación tradicionales, como la inmunohistoquímica y los experimentos de unión de radioligandos, pueden proporcionar información estática sobre la distribución de péptidos opioides, son difíciles de capturar el proceso de liberación dinámica y el patrón de distribución espaciotemporal fino de los péptidos opioides en el sistema nervioso vivo.

Especialmente cuando se explora la función de los péptidos opioides en circuitos neuronales específicos y se exploran los cambios dinámicos de la liberación de péptidos opioides en estados de comportamiento complejos, las tecnologías existentes suelen ser insuficientes.

Para superar los obstáculos mencionados anteriormente, Dong Chunyang y sus colaboradores desarrollaron esta estrategia de sonda fluorescente del receptor de opioides basada en la codificación genética.

Anteriormente, el supervisor doctoral de Dong Chunyang había desarrollado una sonda de iones de calcio GCaMP3, que puede utilizar la fluorescencia para analizar la actividad nerviosa cerebral en múltiples especies, haciendo una contribución importante a la detección de actividad neuronal con alta resolución espacial y temporal.

También sentó una cierta base para la optimización de las sondas de iones de calcio. Actualmente, la serie GCaMP de sondas de iones de calcio se ha utilizado ampliamente en el campo de la neurociencia.

Los logros mencionados anteriormente del instructor Dong Chunyang sentaron las bases para el desarrollo de nuevas sondas de neurotransmisores.

Bajo la dirección de su mentor, Dong Chunyang ha participado en el estudio de sondas de dopamina desplazadas al rojo en los últimos años y ha desarrollado dos sondas de serotonina y varias otras sondas de neuropéptidos.

Al mismo tiempo, Dong Chunyang también colaboró ​​con el equipo del profesor Li Yulong de la Universidad de Pekín para publicar un artículo de revisión sobre el desarrollo y aplicación de sondas de neurotransmisores. Estas experiencias le proporcionaron ideas para explorar sondas de péptidos opioides más complejas.

Sobre esta base, Dong Chunyang se dio cuenta de que el desarrollo de sondas de péptidos opioides enfrentaba mayores desafíos que las sondas de neurotransmisores desarrolladas anteriormente.

La complejidad del sistema de péptidos opioides, que incluye múltiples péptidos opioides endógenos y múltiples subtipos de receptores, hace que sea particularmente difícil desarrollar sondas altamente específicas.

Y a diferencia de otras sondas, no existe una fórmula preparada a seguir para el desarrollo de sondas de péptidos opioides. Esto significa que cada variante de sonda debe diseñarse individualmente y verificarse una por una, lo que aumenta considerablemente la carga de trabajo y la complejidad.

Por ejemplo, es necesario encontrar el sitio de inserción de la proteína fluorescente óptimo y la secuencia de conexión manteniendo al mismo tiempo la función del receptor. Durante este período, se involucró mucho trabajo de biología molecular, incluido el diseño, construcción y detección de cientos de variantes diferentes.

Durante la fase de caracterización in vitro, es necesario evaluar cuidadosamente cada variante de la sonda para determinar su respuesta a diferentes péptidos opioides y subtipos de receptores. Incluyendo la determinación detallada del rango dinámico, la sensibilidad, la selectividad y la cinética de reacción de la sonda.

A través de una gran cantidad de experimentos de caracterización in vitro, Dong Chunyang y otros seleccionaron variantes con mayor rango dinámico, mayor sensibilidad y mayor especificidad.

Posteriormente, llevaron a cabo un trabajo de verificación en torno a la especificidad de la sonda y utilizaron estimulación optogenética del circuito BLA-NAc en experimentos entre ratones knockout para dinorfina y ratones de tipo salvaje para demostrar la especificidad de κLight para el sexo de dinorfina.

Esto no sólo garantiza que la sonda pueda seguir manteniendo la especificidad y la sensibilidad en entornos neuronales complejos, sino que también garantiza la fiabilidad de la sonda cuando los usuarios la utilizan en condiciones fisiológicas.

(Fuente: Neurociencia de la naturaleza)

Innumerables repeticiones, fallos, optimizaciones y repeticiones.

Dong Chunyang dijo que uno de los objetivos de esta investigación es caracterizar de manera integral las propiedades farmacológicas de estas nuevas sondas in vitro y en cortes de cerebro aislados.

Esto incluye determinar la afinidad, selectividad y características cinéticas de las sondas para diferentes péptidos opioides endógenos y sintéticos.

Después de compararlos con experimentos tradicionales de unión de radioligandos, esperan verificar si estas sondas reflejan con precisión la interacción de los péptidos opioides con los receptores.

Al mismo tiempo, también es necesario evaluar si la expresión de la sonda afectará la función normal de los receptores opioides endógenos para asegurar su valor de aplicación en condiciones fisiológicas.

El segundo objetivo de este estudio es utilizar estas sondas para explorar las características de difusión de los péptidos opioides en el tejido cerebral.

Anteriormente se creía que los péptidos opioides actuaban principalmente mediante transporte volumétrico. Sin embargo, aún faltan pruebas directas del alcance específico y la velocidad de difusión.

Para ello, el grupo de investigación diseñó un ingenioso experimento de fotólisis para monitorear simultáneamente los cambios en las señales de fluorescencia mediante la liberación de precursores de péptidos opioides fotosensibles, logrando así por primera vez la observación en tiempo real y el análisis cuantitativo del proceso de difusión de los péptidos opioides.

A través de este experimento,No sólo revelaron la constante de difusión de los péptidos opioides, sino que también proporcionaron una base importante para comprender la extensión espacial de las señales de los péptidos opioides.

El tercer objetivo de este estudio fue determinar los parámetros óptimos de estimulación eléctrica que desencadenan la liberación de péptidos opioides endógenos, lo cual es fundamental para estudiar la función de los péptidos opioides in vivo.

Al ajustar sistemáticamente la intensidad de la estimulación, la frecuencia de la estimulación y la duración de la estimulación en cortes de cerebro, así como monitorear la respuesta de las sondas fluorescentes, el equipo espera encontrar el modo de estimulación más efectivo, sentando así una cierta base para los experimentos electrofisiológicos y optogenéticos.

En experimentos con animales vivos, combinaron estas sondas fluorescentes con técnicas optogenéticas para explorar la dinámica de la liberación de péptidos opioides en circuitos neuronales específicos.

Por ejemplo, al expresar una sonda κLight en el núcleo accumbens y un canal iónico sensible a la luz en la amígdala, se puede controlar con precisión la activación de proyecciones específicas y se puede observar en tiempo real la liberación endógena de dinorfina resultante.

El beneficio de este enfoque es que no sólo proporciona una resolución temporal y espacial sin precedentes, sino que también revela la especificidad espacial de la liberación de péptidos opioides.

Además, el equipo de investigación también llevó a cabo las siguientes exploraciones: explorar los cambios dinámicos en la liberación de péptidos opioides en estados de comportamiento complejos, como durante el condicionamiento del miedo y el aprendizaje de recompensa.

Al realizar fotometría de fibra óptica en animales que se movían libremente, Dong Chunyang y otros utilizaron sondas para capturar cambios en las señales de los péptidos opioides relacionados con comportamientos específicos.

Todavía recuerda la primera vez que capturó con éxito el momento de la liberación del péptido opioide endógeno en ratones vivos. "Pasamos varios años optimizando la sonda y finalmente confirmamos una variante in vitro que se espera que se utilice con éxito in vivo", afirmó.

Específicamente, empaquetaron el plásmido κLight en un virus adenoasociado. Después de familiarizarse con las coordenadas del área del cerebro del ratón, comenzaron la inyección intracraneal del virus y luego esperaron a que la sonda se expresara en el cerebro del ratón.

“Después de innumerables repeticiones, fallas, optimizaciones y repeticiones, cuando vi la sonda κLight en la pantalla de la computadora que registraba la luz a medida que avanzaba la estimulación del condicionamiento del miedo, comenzaron a aparecer picos de señales brillantes uno tras otro, lo que realmente me conmovió "Dong Chunyang. dicho.

Sin embargo, la racionalidad científica rápidamente lo hizo retroceder y tuvo que demostrar que lo que vio era la señal de dinorfina detectada por κLight y no otros artefactos.

Después de demostrar la reproducibilidad del fenómeno anterior a través de múltiples ratones, el equipo de investigación diseñó diferentes experimentos, especialmente experimentos optogenéticos utilizando ratones knockout para dinorfina, para demostrar que en ausencia de dinorfina y la misma estimulación, el equipo de investigación no aparece ninguna señal de la aguja. demostrando así la precisión y especificidad de la sonda.

Finalmente, cuando cada experimento arrojó un resultado con una fuerte especificidad y una alta relación señal-ruido, todos finalmente dejaron de lado el suspenso.

(Fuente: Neurociencia de la naturaleza)

Finalmente, el artículo relacionado se publicó en Nature Neuroscience (IF 21.2) con el título "Desbloqueo de la dinámica de neuropéptidos opioides con biosensores codificados genéticamente".

Figura | Artículos relacionados (Fuente: Nature Neuroscience)

Dong Chunyang y Raajaram Gowrishankar de la Universidad de Washington son coautores.

El profesor Michael R. Bruchas de la Universidad de Washington, el profesor Matthew R. Banghart de la Universidad de California, San Diego, y el profesor Tian Lin del Instituto Max Planck de Neurociencia de Florida actúan como coautores.

Con este logro, Dong Chunyang ganó el Premio Toni Shippenberg al Joven Investigador de los Institutos Nacionales de Salud.

En términos de perspectivas de aplicación:

En primer lugar, puede utilizarse en la investigación básica de neurociencia.

La sonda fluorescente del receptor de opioides creada esta vez permitirá a las personas observar y medir con mayor precisión los cambios dinámicos de los péptidos opioides en el sistema nervioso, ayudando así a revelar el papel específico del sistema opioide en diversos procesos neuronales, como revelar el papel de aprendizaje, efecto memoria, efecto regulación de emociones, etc.

En segundo lugar, puede utilizarse para la investigación del dolor.

En la modulación del dolor, el sistema opioide juega un papel clave. Por lo tanto, se espera que esta sonda se utilice para estudiar los patrones de liberación de péptidos opioides en estados de dolor agudo y crónico, ayudando así a desarrollar estrategias de manejo del dolor más efectivas.

En tercer lugar, puede utilizarse para estudiar los mecanismos de adicción.

Al monitorear la actividad de los péptidos opioides en los circuitos de recompensa en tiempo real, podremos comprender mejor las bases neurobiológicas de la drogadicción y proporcionar pistas para el desarrollo de nuevos tratamientos.

En cuarto lugar, puede utilizarse para el desarrollo y la detección de fármacos.

Es decir, esta sonda se puede utilizar para la detección de alto rendimiento para ayudar a identificar nuevos moduladores de los receptores opioides, ayudando así a desarrollar fármacos analgésicos más seguros y eficaces.

En quinto lugar, puede utilizarse en investigaciones sobre trastornos del estado de ánimo.

Dada la estrecha relación entre el sistema opioide y la regulación de las emociones, se espera que esta sonda se utilice para estudiar los mecanismos neuronales de la depresión, la ansiedad y otros trastornos del estado de ánimo.

En sexto lugar, puede utilizarse para aplicaciones de neuroimagen.

Cuando se modifiquen estas sondas, se espera que se utilicen en técnicas de imágenes cerebrales no invasivas para observar la actividad del sistema opioide en el cerebro humano.

En séptimo lugar, puede utilizarse para desarrollar tecnología de neuromodulación.

Combinadas con la optogenética o la genética química, se espera que estas sondas ayuden a desarrollar técnicas de neuromodulación más precisas para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema opioide.

En octavo lugar, puede utilizarse en la investigación de la neurociencia del comportamiento.

Es decir, se utiliza para estudiar el papel del sistema opioide en funciones cognitivas avanzadas como el comportamiento social complejo y la toma de decisiones.

Nueve, puede usarse para prevenir el abuso de drogas.

Obtener una comprensión más profunda de la función del sistema opioide podría ayudar a desarrollar estrategias y métodos educativos de prevención del abuso de drogas más eficaces.

Décimo, puede utilizarse para la medicina personalizada.

Al estudiar las diferencias en la respuesta del sistema opioide en diferentes individuos en modelos animales, puede proporcionar una base teórica para el tratamiento individualizado del dolor y el manejo de la adicción.

En conjunto, se espera que estas aplicaciones potenciales no sólo hagan avanzar la investigación básica en neurociencia, sino que también puedan tener un impacto significativo en la medicina clínica, el desarrollo de fármacos y las políticas de salud pública.

Por supuesto, se necesitarán muchos años de investigación y verificación para pasar de la investigación básica a las aplicaciones prácticas.

Y en el futuro:

En primer lugar, se mejorará el rendimiento de las sondas existentes.

Es decir, mejorar la especificidad, sensibilidad, rango dinámico y propiedades cinéticas de las sondas de neuropéptidos existentes.

Esto puede implicar estrategias de ingeniería de proteínas más complejas, como la evolución dirigida asistida por IA, el diseño racional guiado por la biología estructural, etc.

En segundo lugar, se desarrollarán sondas fluorescentes dirigidas a más neuropéptidos.

Es decir, ampliar la experiencia existente a otros sistemas de neuropéptidos, neurotransmisores y neuromoduladores.

En tercer lugar, combinar las sondas existentes con otras técnicas de imagen.

Por ejemplo, se espera que la combinación de sondas de neuropéptidos con microscopía de superresolución o microscopía miniaturizada de dos fotones permita a las personas observar la dinámica de liberación de neuropéptidos a nivel subcelular o en animales que se mueven libremente.

Al mismo tiempo, con la ayuda de la tecnología de imágenes multicolores, las personas pueden observar la dinámica de múltiples neuropéptidos o neurotransmisores simultáneamente, revelando así las interacciones entre ellos.

Finalmente, la aplicación de estas sondas no se limita a la investigación básica, sino que también tiene el potencial de extenderse al campo del desarrollo de fármacos, es decir, desarrollar plataformas de detección de alto rendimiento para ayudar a descubrir nuevos fármacos neuropsiquiátricos.

Para las sondas de neuropéptidos, también continuará promoviendo el desarrollo de la investigación en neurociencia hacia una mayor resolución espaciotemporal, una diversidad molecular más amplia y paradigmas de comportamiento más complejos, brindando apoyo para comprender la función cerebral y desarrollar nuevas estrategias de tratamiento.

Referencias:

1. Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y. et al. Desbloqueo de la dinámica de los neuropéptidos opioides con biosensores codificados genéticamente. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

Operación/composición tipográfica: He Chenlong

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