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Recentemente, Dong Chunyang, un dottorato di ricerca diretto presso l'Università della California, Davis, e attualmente impegnato nella ricerca post-dottorato presso l'Università di Stanford, ha sviluppato congiuntamente una nuova sonda fluorescente codificata geneticamente, che fornisce uno strumento innovativo per lo studio della dinamica dei neuropeptidi.

Immagine |. Dong Chunyang (Fonte: Dong Chunyang)

Secondo i rapporti,L’idea centrale di questo studio è fondere le proteine ​​fluorescenti con i recettori degli oppioidi e riflettere il processo di legame dei peptidi oppioidi in tempo reale attraverso cambiamenti nei segnali di fluorescenza causati dai cambiamenti nella conformazione dei recettori.

Durante questo periodo, Dong Chunyang e altri hanno progettato le corrispondenti sonde fluorescenti κLight, δLight e μLight rispettivamente per i tre principali sottotipi di recettori oppioidi: recettore κ, recettore δ e recettore μ.

In questo modo, non solo è possibile distinguere diversi tipi di peptidi oppioidi, ma è possibile ottenere il rilevamento del segnale con elevata risoluzione spaziotemporale a livello di singola cellula.

(Fonte: Nature Neuroscience)

Attraverso lo sviluppo e l'applicazione di nuove sonde fluorescenti, questo studio mira a esplorare in profondità le funzioni e i meccanismi di regolazione del sistema peptidico oppioide da più livelli.

Ciò non solo aiuterà le persone a comprendere il ruolo del sistema oppioide nel comportamento emotivo e motivazionale, ma potrebbe anche fornire nuove intuizioni sulla comprensione e sul trattamento delle malattie mentali correlate.

Studiando le interazioni recettore-ligando a livello molecolare, la segnalazione a livello cellulare e di circuito e la regolazione funzionale a livello comportamentale generale, si prevede che questo risultato porterà progressi rivoluzionari allo studio del sistema degli oppioidi.

Costituisce un passo importante verso una migliore comprensione del sistema degli oppioidi endogeni e fornisce un nuovo prezioso strumento per lo studio del sistema dei peptidi oppioidi.

Le sonde per gli oppioidi endogeni e sintetici rappresentano una grande aggiunta all’attuale “cassetta degli attrezzi” delle neuroscienze e possono portare a un migliore campionamento spaziotemporale della segnalazione degli oppioidi.

Ciò non solo promuoverà lo sviluppo della ricerca di base nel campo delle neuroscienze, ma aprirà anche nuove prospettive per applicazioni cliniche come la gestione del dolore e il trattamento delle dipendenze.

(Fonte: Nature Neuroscience)

Cominciamo con lo “status” dei neuropeptidi oppioidi

Secondo i rapporti, nel campo delle neuroscienze, il sistema dei neuropeptidi oppioidi occupa una posizione centrale.

Essendo una sostanza chiave neuromodulatrice, i peptidi oppioidi svolgono un ruolo indispensabile nella regolazione di molteplici processi fisiologici e patologici come la percezione del dolore, il comportamento di ricompensa, la risposta emotiva e la dipendenza.

Tuttavia, la ricerca approfondita sul sistema peptidico degli oppioidi endogeni è stata a lungo limitata dai mezzi tecnici.

Sebbene i metodi di ricerca tradizionali come l’immunoistochimica e gli esperimenti di legame con radioligandi possano fornire informazioni statiche sulla distribuzione dei peptidi oppioidi, sono difficili da catturare il processo di rilascio dinamico e il modello di distribuzione spaziotemporale fine dei peptidi oppioidi nel sistema nervoso vivente.

Soprattutto quando si esplora la funzione dei peptidi oppioidi in specifici circuiti neurali e si esplorano i cambiamenti dinamici del rilascio dei peptidi oppioidi in stati comportamentali complessi, le tecnologie esistenti sono spesso insufficienti.

Per superare i colli di bottiglia di cui sopra, Dong Chunyang e i suoi collaboratori hanno sviluppato questa strategia di sonda fluorescente del recettore degli oppioidi basata sulla codifica genetica.

In precedenza, il supervisore del dottorato di Dong Chunyang aveva sviluppato una sonda agli ioni di calcio GCaMP3, che può utilizzare la fluorescenza per analizzare l'attività dei nervi cerebrali in più specie, fornendo un importante contributo al rilevamento dell'attività neurale con elevata risoluzione spaziale e temporale.

Ha inoltre gettato alcune basi per l'ottimizzazione delle sonde di ioni calcio Attualmente, la serie GCaMP di sonde di ioni calcio è stata ampiamente utilizzata nel campo delle neuroscienze.

I risultati sopra menzionati dell'istruttore Dong Chunyang hanno gettato le basi per lo sviluppo di nuove sonde neurotrasmettitori.

Sotto la guida del suo mentore, Dong Chunyang ha partecipato negli ultimi anni allo studio delle sonde della dopamina spostate verso il rosso e ha sviluppato due sonde della serotonina e varie altre sonde neuropeptidiche.

Allo stesso tempo, Dong Chunyang ha anche collaborato con il team del professor Li Yulong dell'Università di Pechino per pubblicare un documento di revisione sullo sviluppo e l'applicazione delle sonde dei neurotrasmettitori. Queste esperienze gli hanno fornito spunti per esplorare sonde peptidiche oppioidi più complesse.

Su questa base, Dong Chunyang si è reso conto che lo sviluppo di sonde peptidiche oppioidi avrebbe dovuto affrontare sfide maggiori rispetto alle sonde neurotrasmettitori sviluppate in precedenza.

La complessità del sistema peptidico degli oppioidi, che comprende molteplici peptidi oppioidi endogeni e molteplici sottotipi di recettori, rende particolarmente difficile lo sviluppo di sonde altamente specifiche.

E a differenza di altre sonde, non esiste una formula già pronta da seguire per lo sviluppo delle sonde peptidiche oppioidi. Ciò significa che ciascuna variante della sonda deve essere progettata individualmente e verificata una per una, il che aumenta notevolmente il carico di lavoro e la complessità.

Ad esempio, è necessario trovare il sito di inserimento della proteina fluorescente ottimale e la sequenza di connessione mantenendo la funzione del recettore. Durante questo periodo è stato coinvolto molto lavoro di biologia molecolare, inclusa la progettazione, la costruzione e lo screening di centinaia di varianti diverse.

Durante la fase di caratterizzazione in vitro, ciascuna variante della sonda deve essere attentamente valutata per la sua risposta a diversi peptidi oppioidi e sottotipi di recettori. Compresa la determinazione dettagliata del range dinamico, della sensibilità, della selettività e della cinetica di reazione della sonda.

Attraverso un gran numero di esperimenti di caratterizzazione in vitro, Dong Chunyang e altri hanno selezionato varianti con un intervallo dinamico più ampio, una sensibilità più elevata e una specificità più elevata.

Successivamente, hanno effettuato un lavoro di verifica sulla specificità della sonda e hanno utilizzato la stimolazione optogenetica del circuito BLA-NAc in esperimenti tra topi knockout per la dinorfina e topi wild-type per dimostrare la specificità di κLight per il sesso della dinorfina.

Ciò non solo garantisce che la sonda possa comunque mantenere specificità e sensibilità in ambienti neurali complessi, ma garantisce anche l’affidabilità della sonda quando gli utenti la utilizzano in condizioni fisiologiche.

(Fonte: Nature Neuroscience)

Innumerevoli ripetizioni, fallimenti, ottimizzazioni e ripetizioni

Dong Chunyang ha affermato che uno degli obiettivi di questa ricerca è caratterizzare in modo completo le proprietà farmacologiche di queste nuove sonde in vitro e in fettine di cervello isolate.

Ciò include la determinazione dell'affinità, della selettività e delle caratteristiche cinetiche delle sonde per diversi peptidi oppioidi endogeni e sintetici.

Dopo averli confrontati con i tradizionali esperimenti di legame con radioligandi, sperano di verificare se queste sonde riflettono accuratamente l'interazione dei peptidi oppioidi con i recettori.

Allo stesso tempo, è anche necessario valutare se l’espressione della sonda influenzerà la normale funzione dei recettori oppioidi endogeni per garantirne il valore applicativo in condizioni fisiologiche.

Il secondo obiettivo di questo studio è utilizzare queste sonde per esplorare le caratteristiche di diffusione dei peptidi oppioidi nel tessuto cerebrale.

In precedenza, si credeva che i peptidi oppioidi funzionassero principalmente attraverso il trasporto volumetrico. Tuttavia, mancano ancora prove dirette dell’entità specifica e del tasso di diffusione.

A tal fine, il gruppo di ricerca ha progettato un ingegnoso esperimento di fotolisi per monitorare simultaneamente i cambiamenti nei segnali di fluorescenza rilasciando precursori di peptidi oppioidi fotosensibili, ottenendo così per la prima volta l’osservazione in tempo reale e l’analisi quantitativa del processo di diffusione dei peptidi oppioidi.

Attraverso questo esperimento,Non solo hanno rivelato la costante di diffusione dei peptidi oppioidi, ma hanno anche fornito una base importante per comprendere l’estensione spaziale dei segnali dei peptidi oppioidi.

Il terzo obiettivo di questo studio era determinare i parametri ottimali di stimolazione elettrica che innescano il rilascio di peptidi oppioidi endogeni, che è fondamentale per studiare la funzione dei peptidi oppioidi in vivo.

Regolando sistematicamente l'intensità, la frequenza e la durata della stimolazione in fettine di cervello, nonché monitorando la risposta delle sonde fluorescenti, il team spera di trovare la modalità di stimolazione più efficace, ponendo così una certa base per esperimenti elettrofisiologici ed esperimenti optogenetici.

Negli esperimenti sugli animali vivi, hanno combinato queste sonde fluorescenti con tecniche optogenetiche per esplorare la dinamica del rilascio dei peptidi oppioidi in specifici circuiti neurali.

Ad esempio, esprimendo una sonda κLight nel nucleo accumbens e un canale ionico sensibile alla luce nell'amigdala, l'attivazione di proiezioni specifiche può essere controllata con precisione e il conseguente rilascio di dinorfina endogena può essere osservato in tempo reale.

Il vantaggio di questo approccio è che non solo fornisce una risoluzione temporale e spaziale senza precedenti, ma rivela anche la specificità spaziale del rilascio dei peptidi oppioidi.

Inoltre, il gruppo di ricerca ha anche condotto le seguenti esplorazioni: esplorare i cambiamenti dinamici nel rilascio dei peptidi oppioidi in stati comportamentali complessi, come durante il condizionamento della paura e l’apprendimento della ricompensa.

Eseguendo la fotometria a fibra ottica in animali che si muovevano liberamente, Dong Chunyang e altri hanno utilizzato sonde per catturare i cambiamenti nei segnali dei peptidi oppioidi relativi a comportamenti specifici.

Ricorda ancora la prima volta che riuscì a catturare con successo il momento del rilascio del peptide oppioide endogeno nei topi vivi. "Abbiamo impiegato diversi anni per ottimizzare la sonda e alla fine abbiamo confermato una variante in vitro che dovrebbe essere utilizzata con successo in vivo", ha affermato.

Nello specifico, hanno confezionato il plasmide κLight in un virus adeno-associato. Dopo aver acquisito familiarità con le coordinate dell'area del cervello del topo, hanno iniziato l'iniezione intracranica del virus e quindi hanno aspettato che la sonda si esprimesse nel cervello del topo.

"Dopo innumerevoli ripetizioni, fallimenti, ottimizzazioni e ripetizioni, quando ho visto la sonda κLight sullo schermo del computer che registrava la luce mentre la stimolazione del condizionamento alla paura progrediva, i picchi luminosi del segnale hanno cominciato ad apparire uno dopo l'altro, cosa che mi ha davvero commosso. "Dong Chunyang disse.

Tuttavia, la razionalità scientifica lo ha rapidamente riportato indietro e ha dovuto dimostrare che ciò che vedeva era il segnale della dinorfina rilevato da κLight e non altri artefatti.

Dopo aver dimostrato la riproducibilità del fenomeno di cui sopra su più topi, il gruppo di ricerca ha progettato diversi esperimenti, in particolare esperimenti optogenetici utilizzando topi knockout per la dinorfina, per dimostrare che in assenza di dinorfina e della stessa stimolazione, il gruppo di ricerca non appare alcun segnale dall'ago, dimostrando così l'accuratezza e la specificità della sonda.

Alla fine, quando ogni esperimento indicava un risultato con forte specificità e un elevato rapporto segnale-rumore, tutti finalmente lasciavano andare la suspense.

(Fonte: Nature Neuroscience)

Infine, l'articolo correlato è stato pubblicato su Nature Neuroscience (IF 21.2) con il titolo "Unlocking oppioid neuropeptide Dynamics with geneticaly encoded biosensors".

Figura |. Articoli correlati (Fonte: Nature Neuroscience)

Dong Chunyang e Raajaram Gowrishankar dell'Università di Washington sono coautori.

Il professor Michael R. Bruchas dell'Università di Washington, il professor Matthew R. Banghart dell'Università della California, San Diego e il professor Tian Lin del Max Planck Florida Neuroscience Institute fungono da co-autore corrispondente.

Con questo risultato, Dong Chunyang ha vinto il Toni Shippenberg Young Investigator Award del National Institutes of Health.

In termini di prospettive applicative:

Innanzitutto, può essere utilizzato nella ricerca neuroscientifica di base.

La sonda fluorescente del recettore degli oppioidi creata questa volta consentirà alle persone di osservare e misurare con maggiore precisione i cambiamenti dinamici dei peptidi oppioidi nel sistema nervoso, aiutando così a rivelare il ruolo specifico del sistema oppioide in vari processi neurali, come rivelando il ruolo di apprendimento, effetto memoria, effetto regolazione delle emozioni, ecc.

In secondo luogo, può essere utilizzato per la ricerca sul dolore.

Nella modulazione del dolore, il sistema oppioide gioca un ruolo chiave. Pertanto, si prevede che questa sonda verrà utilizzata per studiare i modelli di rilascio dei peptidi oppioidi negli stati di dolore acuto e cronico, contribuendo così a sviluppare strategie di gestione del dolore più efficaci.

In terzo luogo, può essere utilizzato per studiare i meccanismi di dipendenza.

Monitorando in tempo reale l’attività dei peptidi oppioidi nei circuiti di ricompensa, potremmo essere in grado di comprendere meglio le basi neurobiologiche della tossicodipendenza e fornire indizi per lo sviluppo di nuovi trattamenti.

In quarto luogo, può essere utilizzato per lo sviluppo e lo screening dei farmaci.

Cioè, questa sonda può essere utilizzata per lo screening ad alto rendimento per aiutare a identificare nuovi modulatori dei recettori degli oppioidi, contribuendo così a sviluppare farmaci analgesici più sicuri ed efficaci.

In quinto luogo, può essere utilizzato nella ricerca sui disturbi dell’umore.

Considerando la stretta relazione tra il sistema oppioide e la regolazione delle emozioni, questa sonda dovrebbe essere utilizzata per studiare i meccanismi neurali della depressione, dell’ansia e di altri disturbi dell’umore.

In sesto luogo, può essere utilizzato per applicazioni di neuroimaging.

Quando queste sonde verranno modificate, si prevede che verranno utilizzate in tecniche di imaging cerebrale non invasive per osservare l’attività del sistema oppioide nel cervello umano.

Settimo, può essere utilizzato per sviluppare la tecnologia di neuromodulazione.

Combinate con l’optogenetica o la genetica chimica, si prevede che queste sonde contribuiranno a sviluppare tecniche di neuromodulazione più precise per il trattamento delle malattie legate al sistema oppioide.

Ottavo, può essere utilizzato nella ricerca sulle neuroscienze comportamentali.

Viene cioè utilizzato per studiare il ruolo del sistema oppioide nelle funzioni cognitive avanzate come il comportamento sociale complesso e il processo decisionale.

Nove, può essere usato per prevenire l'abuso di droghe.

Acquisire una comprensione più profonda della funzione del sistema degli oppioidi potrebbe aiutare a sviluppare strategie di prevenzione dell’abuso di droga e metodi educativi più efficaci.

Decimo: può essere utilizzato per la medicina personalizzata.

Studiando le differenze nella risposta del sistema oppioide in diversi individui in modelli animali, si potrebbe fornire una base teorica per il trattamento individualizzato del dolore e la gestione della dipendenza.

Nel loro insieme, si prevede che queste potenziali applicazioni non solo faranno avanzare la ricerca di base nel campo delle neuroscienze, ma potrebbero anche avere un impatto significativo sulla medicina clinica, sullo sviluppo di farmaci e sulla politica di sanità pubblica.

Naturalmente ci vorranno molti anni di ricerca e verifica per passare dalla ricerca di base alle applicazioni pratiche.

E in futuro:

Innanzitutto, verranno migliorate le prestazioni delle sonde esistenti.

Cioè, migliorando la specificità, la sensibilità, la gamma dinamica e le proprietà cinetiche delle sonde neuropeptidiche esistenti.

Ciò potrebbe comportare strategie di ingegneria proteica più complesse, come l’evoluzione diretta assistita dall’intelligenza artificiale, la progettazione razionale guidata dalla biologia strutturale, ecc.

In secondo luogo, verranno sviluppate sonde fluorescenti mirate a più neuropeptidi.

Cioè, estendendo l’esperienza esistente ad altri sistemi neuropeptidici, neurotrasmettitori e neuromodulatori.

In terzo luogo, combinare le sonde esistenti con altre tecniche di imaging.

Ad esempio, si prevede che la combinazione di sonde neuropeptidiche con la microscopia a super risoluzione o con la microscopia miniaturizzata a due fotoni consentirà di osservare le dinamiche di rilascio dei neuropeptidi a livello subcellulare o negli animali che si muovono liberamente.

Allo stesso tempo, con l’aiuto della tecnologia di imaging multicolore, le persone potrebbero essere in grado di osservare simultaneamente la dinamica di più neuropeptidi o neurotrasmettitori, rivelando così le interazioni tra loro.

Infine, l’applicazione di queste sonde non si limita alla ricerca di base, ma ha anche il potenziale per estendersi al campo dello sviluppo di farmaci, ovvero allo sviluppo di piattaforme di screening ad alto rendimento per aiutare a scoprire nuovi farmaci neuropsichiatrici.

Per quanto riguarda le sonde neuropeptidiche, continuerà inoltre a promuovere lo sviluppo della ricerca neuroscientifica verso una maggiore risoluzione spaziotemporale, una più ampia diversità molecolare e paradigmi comportamentali più complessi, fornendo supporto per la comprensione della funzione cerebrale e lo sviluppo di nuove strategie di trattamento.

Riferimenti:

1.Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y.et al. Sbloccare le dinamiche dei neuropeptidi oppioidi con biosensori codificati geneticamente. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

Operazione/composizione: He Chenlong

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