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最近、カリフォルニア大学デービス校を直接博士号取得し、現在スタンフォード大学で博士研究員として研究に従事しているDong Chunyang氏は、神経ペプチド動態の研究に革新的なツールを提供する、新しい遺伝的にコードされた蛍光プローブを共同開発した。

写真 | ドン・チュニャン (出典:ドン・チュニャン)

報道によると、この研究の中心的なアイデアは、蛍光タンパク質をオピオイド受容体と融合させ、受容体の立体構造の変化によって引き起こされる蛍光シグナルの変化を通じて、オピオイドペプチドの結合プロセスをリアルタイムで反映することです。

この期間中、Dong Chunyang らは、3 つの主要なオピオイド受容体サブタイプ (κ 受容体、δ 受容体、μ 受容体) にそれぞれ対応する蛍光プローブ κLight、δLight、μLight を設計しました。

このようにして、異なる種類のオピオイドペプチドを区別できるだけでなく、単一細胞レベルで高い時空間分解能でのシグナル検出を達成することができます。

(出典: Nature Neuroscience)

この研究は、新しい蛍光プローブの開発と応用を通じて、オピオイドペプチドシステムの機能と制御機構を複数のレベルから深く探ることを目的としています。

これは、人々が感情的および動機付けの行動におけるオピオイド系の役割を理解するのに役立つだけでなく、関連する精神疾患の理解と治療についての新たな洞察も提供する可能性があります。

分子レベルでの受容体-リガンド相互作用、細胞および回路レベルでのシグナル伝達、および全体的な行動レベルでの機能制御を研究することにより、この成果はオピオイドシステムの研究に革命的な進歩をもたらすことが期待される。

これは内因性オピオイド システムの理解を深めるための重要な一歩を踏み出し、オピオイド ペプチド システムの研究に貴重な新しいツールを提供します。

内因性および合成オピオイドのプローブは、現在の神経科学の「ツールボックス」への優れた追加であり、オピオイドシグナル伝達のより良い時空間サンプリングにつながる可能性があります。

これにより、神経科学の基礎研究の発展が促進されるだけでなく、疼痛管理や依存症治療などの臨床応用への新たな展望も開かれることになります。

(出典: Nature Neuroscience)

オピオイド神経ペプチドの「状態」から始めましょう

報告によると、神経科学の分野では、オピオイド神経ペプチドシステムが中心的な位置を占めています。

オピオイドペプチドは、重要な神経調節物質として、痛みの知覚、報酬行動、感情反応、依存症などの複数の生理学的および病理学的プロセスの調節に不可欠な役割を果たします。

しかし、内因性オピオイドペプチドシステムに関する詳細な研究は、長い間、技術的手段によって制限されてきました。

免疫組織化学や放射性リガンド結合実験などの従来の研究方法は、静的なオピオイドペプチド分布情報を提供できますが、生きた神経系におけるオピオイドペプチドの動的な放出プロセスや微細な時空間分布パターンを捕捉することは困難です。

特に、特定の神経回路におけるオピオイドペプチドの機能を調査したり、複雑な行動状態下でのオピオイドペプチド放出の動的な変化を調査したりする場合、既存の技術では不十分なことがよくあります。

上記のボトルネックを打破するために、Dong Chunyang と彼の共同研究者は、遺伝暗号に基づいたこのオピオイド受容体蛍光プローブ戦略を開発しました。

以前、Dong Chunyang 博士の指導教員は、蛍光を使用して複数の種の脳神経活動を分析できるカルシウム イオン プローブ GCaMP3 を開発しており、高い空間的および時間的分解能での神経活動の検出に重要な貢献をしました。

また、カルシウムイオンプローブの最適化のための一定の基礎も築かれ、現在、カルシウムイオンプローブのGCaMPシリーズは神経科学の分野で広く使用されています。

ドン・チュニャン講師の上記の業績は、新しい神経伝達物質プローブ開発の基礎を築きました。

指導者の指導の下、Dong Chunyang 氏は過去数年間、赤方偏移ドーパミン プローブの研究に参加し、2 つのセロトニン プローブとその他のさまざまな神経ペプチド プローブを開発しました。

同時に、Dong Chunyang 氏は北京大学の Li Yulong 教授のチームと協力して、神経伝達物質プローブの開発と応用に関する総説論文を発表しました。これらの経験により、彼はより複雑なオピオイド ペプチド プローブを探索するための洞察を得ることができました。

これに基づいて、Dong Chunyang は、オピオイドペプチドプローブの開発は、以前に開発された神経伝達物質プローブよりも大きな課題に直面していることに気づきました。

複数の内因性オピオイドペプチドおよび複数の受容体サブタイプを含むオピオイドペプチドシステムの複雑さにより、特異性の高いプローブの開発が特に困難になっています。

また、他のプローブとは異なり、オピオイドペプチドプローブの開発に従うべき既製の公式はありません。これは、各プローブのバリアントを個別に設計し、1 つずつ検証する必要があることを意味し、作業負荷と複雑さが大幅に増加します。

例えば、受容体の機能を維持しながら、最適な蛍光タンパク質の挿入部位や接続配列を見つける必要があります。この期間中、数百もの異なる変異体の設計、構築、スクリーニングなど、多くの分子生物学の作業が行われました。

in vitro 特性評価段階では、各プローブ バリアントのさまざまなオピオイド ペプチドおよび受容体サブタイプに対する応答を注意深く評価する必要があります。プローブのダイナミックレンジ、感度、選択性、反応速度論の詳細な決定が含まれます。

Dong Chunyang らは、多数の in vitro 特性評価実験を通じて、より大きなダイナミック レンジ、より高い感度、より高い特異性を備えた変異体を選別しました。

その後、彼らはプローブの特異性に関する検証作業を実施し、ダイノルフィンノックアウトマウスと野生型マウスの間の実験でBLA-NAc回路の光遺伝学的刺激を使用して、ダイノルフィンの性別に対するκLightの特異性を証明した。

これにより、プローブが複雑な神経環境においても特異性と感度を維持できることが保証されるだけでなく、ユーザーが生理学的条件下でプローブを使用する際のプローブの信頼性も保証されます。

(出典: Nature Neuroscience)

数えきれないほどの繰り返し、失敗、最適化、繰り返し

Dong Chunyang 教授は、この研究の目的の 1 つは、これらの新しいプローブの薬理学的特性を in vitro および分離された脳スライスで包括的に特徴付けることであると述べました。

これには、さまざまな内因性オピオイドペプチドおよび合成オピオイドペプチドに対するプローブの親和性、選択性、および速度論的特徴を決定することが含まれます。

彼らは、それらを従来の放射性リガンド結合実験と比較した後、これらのプローブがオピオイドペプチドと受容体の相互作用を正確に反映しているかどうかを検証したいと考えている。

同時に、生理的条件下での応用価値を確保するために、プローブの発現が内因性オピオイド受容体の正常な機能に影響を与えるかどうかを評価することも必要です。

この研究の 2 番目の目標は、これらのプローブを使用して脳組織におけるオピオイドペプチドの拡散特性を調査することです。

以前は、オピオイドペプチドは主に容積輸送によって作用すると考えられていました。しかし、拡散の具体的な範囲と速度についての直接的な証拠はまだ不足しています。

そこで研究グループは、感光性オピオイドペプチド前駆体を放出させて蛍光シグナルの変化を同時にモニタリングする独創的な光分解実験を設計し、オピオイドペプチドの拡散過程のリアルタイム観察と定量解析を初めて実現した。

この実験を通して、これらは、オピオイドペプチドの拡散定数を明らかにしただけでなく、オピオイドペプチドシグナルの空間的広がりを理解するための重要な基礎も提供しました。

この研究の 3 番目の目標は、内因性オピオイド ペプチドの放出を引き起こす最適な電気刺激パラメーターを決定することであり、これは in vivo でのオピオイド ペプチドの機能を研究するために重要です。

研究チームは、脳スライスにおける刺激強度、刺激頻度、刺激持続時間を体系的に調整し、蛍光プローブの反応をモニタリングすることで、最も効果的な刺激モードを見つけ、それによって電気生理学的実験や光遺伝学実験のための一定の基盤を築くことを期待している。

生きた動物実験で、彼らはこれらの蛍光プローブを光遺伝学技術と組み合わせて、特定の神経回路におけるオピオイドペプチド放出の動態を調査しました。

たとえば、側坐核でκLight プローブを発現させ、扁桃体で光感受性イオンチャネルを発現させることにより、特定の突起の活性化を正確に制御でき、その結果生じる内因性ダイノルフィンの放出をリアルタイムで観察できます。

このアプローチの利点は、前例のない時間的および空間的分解能を提供するだけでなく、オピオイドペプチド放出の空間的特異性も明らかにできることです。

さらに、研究チームは、恐怖条件付けや報酬学習中などの複雑な行動状態下でのオピオイドペプチド放出の動的な変化の調査も実施しました。

Dong Chunyangらは、自由に動く動物で光ファイバー測光を行うことにより、プローブを使用して特定の行動に関連するオピオイドペプチドシグナルの変化を捕捉した。

彼は、生きたマウスの内因性オピオイドペプチド放出の瞬間を初めて捉えることに成功したときのことを今でも覚えています。 「我々はプローブの最適化に数年を費やし、最終的には生体内での使用に成功すると予想される変異体を試験管内で確認した」と同氏は述べた。

具体的には、マウスの脳領域の座標を把握した後、κLight プラスミドをアデノ随伴ウイルスにパッケージングし、ウイルスの頭蓋内注射を開始し、マウスの脳でプローブが発現するのを待ちました。

「数え切れないほどの繰り返し、失敗、最適化、繰り返しの後、恐怖条件付け刺激が進行するにつれて光記録コンピューターの画面にκLight プローブが表示されるのを見たとき、明るい信号のピークが次々と現れ始め、本当に感動しました。」言った。

しかし、科学的合理性はすぐに彼を引き戻し、彼が見たものはκライトによって検出されたダイノルフィンの信号であり、他の人工物ではないことを証明しなければなりませんでした。

複数のマウスを使って上記の現象の再現性を証明した後、研究チームはさまざまな実験、特にダイノルフィンノックアウトマウスを使った光遺伝学的実験を計画し、ダイノルフィンが存在せず、同じ刺激が与えられた場合には針から信号が現れないことを証明しました。これにより、プローブの精度と特異性が実証されます。

最後に、各実験で強い特異性と高い信号対雑音比の結果が示されたとき、誰もがついに緊張を解き放ちました。

(出典: Nature Neuroscience)

最後に、関連する論文が「遺伝的にコード化されたバイオセンサーによるオピオイド神経ペプチド動態の解明」というタイトルで Nature Neuroscience (IF 21.2) に掲載されました。

図 | 関連論文 (出典: Nature Neuroscience)

ワシントン大学の Dong Chunyang 氏と Raajaram Gowrishankar 氏が共著者です。

ワシントン大学のマイケル・R・ブルカス教授、カリフォルニア大学サンディエゴ校のマシュー・R・バンガート教授、マックス・プランク・フロリダ神経科学研究所のティアン・リン教授が共同特派著者を務める。

この功績により、Dong Chunyang は国立衛生研究所から Toni Shippenberg Young Investigator Award を受賞しました。

アプリケーションの見通しに関しては、次のとおりです。

まず、基礎的な神経科学研究に使用できます。

今回作製したオピオイド受容体蛍光プローブにより、神経系におけるオピオイドペプチドの動的な変化をより正確に観察・測定できるようになり、さまざまな神経過程におけるオピオイドシステムの具体的な役割の解明に貢献します。学習、記憶効果、感情調整効果など。

第二に、痛みの研究に使用できます。

痛みの調節においては、オピオイド系が重要な役割を果たします。したがって、このプローブは、急性疼痛状態および慢性疼痛状態におけるオピオイドペプチドの放出パターンの研究に使用され、それによってより効果的な疼痛管理戦略の開発に役立つことが期待されます。

第三に、依存症のメカニズムを研究するために使用できます。

報酬回路におけるオピオイドペプチドの活性をリアルタイムでモニタリングすることで、薬物中毒の神経生物学的基盤をより深く理解し、新しい治療法開発の手がかりを提供できる可能性があります。

第四に、医薬品開発および医薬品スクリーニングに使用できます。

つまり、このプローブは、新しいオピオイド受容体モジュレーターの同定を支援するハイスループットスクリーニングに使用でき、それにより、より安全でより効果的な鎮痛薬の開発に役立ちます。

第五に、気分障害の研究に使用できることです。

オピオイド系と感情調節との密接な関係を考慮すると、このプローブはうつ病、不安、その他の気分障害の神経機構の研究に使用されることが期待されます。

第 6 に、神経画像アプリケーションに使用できます。

これらのプローブが修飾されれば、人間の脳のオピオイド系の活動を観察するための非侵襲的な脳画像技術に使用されることが期待されます。

第 7 に、神経調節技術の開発に使用できます。

これらのプローブを光遺伝学または化学遺伝学と組み合わせることで、オピオイド系に関連する疾患を治療するためのより正確な神経調節技術の開発に役立つことが期待されます。

第 8 に、行動神経科学の研究に使用できます。

つまり、複雑な社会的行動や意思決定などの高度な認知機能におけるオピオイド系の役割を研究するために使用されます。

9、薬物乱用を防ぐために使用できます。

オピオイドシステムの機能をより深く理解することは、より効果的な薬物乱用防止戦略や教育方法の開発に役立つ可能性があります。

十番目に、個別化医療に利用できること。

動物モデルでさまざまな個体におけるオピオイド系の反応の違いを研究することにより、個別の疼痛治療や依存症管理の理論的基礎を提供できる可能性があります。

これらの潜在的な応用を総合すると、神経科学の基礎研究を前進させるだけでなく、臨床医学、医薬品開発、公衆衛生政策にも大きな影響を与える可能性があります。

もちろん、基礎研究から実用化までには長年の研究と検証が必要です。

そして将来的には：

まず、既存のプローブの性能が向上します。

つまり、既存の神経ペプチドプローブの特異性、感度、ダイナミックレンジ、および速度論的特性を改善することです。

これには、AI 支援の指向進化、構造生物学に基づく合理的な設計など、より複雑なタンパク質工学戦略が含まれる可能性があります。

第二に、より多くの神経ペプチドをターゲットとする蛍光プローブが開発されるでしょう。

つまり、既存の経験を他の神経ペプチドシステム、神経伝達物質、神経調節物質に拡張することです。

第三に、既存のプローブと他のイメージング技術を組み合わせます。

例えば、神経ペプチドプローブと超解像顕微鏡または小型二光子顕微鏡を組み合わせることで、細胞内レベルまたは自由に移動する動物における神経ペプチドの放出ダイナミクスを観察できるようになると期待されています。

同時に、多色イメージング技術の助けを借りて、複数の神経ペプチドまたは神経伝達物質の動態を同時に観察し、それらの間の相互作用を明らかにできる可能性があります。

最後に、これらのプローブの応用は基礎研究に限定されず、医薬品開発の分野、つまり新しい精神神経薬の発見を支援するハイスループットスクリーニングプラットフォームの開発にも拡張できる可能性があります。

神経ペプチドプローブについては、より高い時空間分解能、より広範な分子多様性、より複雑な行動パラダイムに向けた神経科学研究の発展を引き続き推進し、脳機能の理解と新しい治療戦略の開発をサポートします。

参考文献:

1.Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y.et al. 遺伝子コード化バイオセンサーによるオピオイド神経ペプチド動態の解明。Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

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