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Récemment, Dong Chunyang, titulaire d'un doctorat direct de l'Université de Californie à Davis et actuellement engagé dans des recherches postdoctorales à l'Université de Stanford, a développé conjointement une nouvelle sonde fluorescente génétiquement codée, qui fournit un outil innovant pour l'étude de la dynamique des neuropeptides.

Photo | Dong Chunyang (Source : Dong Chunyang)

Selon les rapports,L'idée principale de cette étude est de fusionner des protéines fluorescentes avec des récepteurs opioïdes et de refléter le processus de liaison des peptides opioïdes en temps réel grâce à des changements dans les signaux de fluorescence provoqués par des changements dans la conformation des récepteurs.

Au cours de cette période, Dong Chunyang et d'autres ont conçu des sondes fluorescentes correspondantes κLight, δLight et μLight respectivement pour les trois principaux sous-types de récepteurs opioïdes - le récepteur κ, le récepteur δ et le récepteur μ.

De cette façon, non seulement il est possible de distinguer différents types de peptides opioïdes, mais la détection des signaux avec une résolution spatio-temporelle élevée peut également être obtenue au niveau d'une seule cellule.

(Source : Nature Neurosciences)

Grâce au développement et à l'application de nouvelles sondes fluorescentes, cette étude vise à explorer en profondeur les fonctions et les mécanismes de régulation du système peptidique opioïde à plusieurs niveaux.

Cela aidera non seulement les gens à comprendre le rôle du système opioïde dans le comportement émotionnel et motivationnel, mais pourrait également fournir de nouvelles informations sur la compréhension et le traitement des maladies mentales associées.

En étudiant les interactions récepteur-ligand au niveau moléculaire, la signalisation aux niveaux cellulaire et des circuits et la régulation fonctionnelle au niveau comportemental global, cette réalisation devrait apporter des progrès révolutionnaires dans l’étude du système opioïde.

Il constitue une étape importante vers une meilleure compréhension du système opioïde endogène et constitue un nouvel outil précieux pour l’étude du système peptidique opioïde.

Les sondes pour les opioïdes endogènes et synthétiques constituent un excellent ajout à la « boîte à outils » actuelle des neurosciences et peuvent conduire à un meilleur échantillonnage spatio-temporel de la signalisation des opioïdes.

Cela favorisera non seulement le développement de la recherche fondamentale en neurosciences, mais ouvrira également de nouvelles perspectives pour des applications cliniques telles que la gestion de la douleur et le traitement des addictions.

(Source : Nature Neurosciences)

Commençons par le « statut » des neuropeptides opioïdes

Selon certaines informations, dans le domaine des neurosciences, le système neuropeptide opioïde occupe une position centrale.

En tant que substance neuromodulatrice clé, les peptides opioïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation de multiples processus physiologiques et pathologiques tels que la perception de la douleur, le comportement de récompense, la réponse émotionnelle et la dépendance.

Cependant, les recherches approfondies sur le système peptidique opioïde endogène ont longtemps été limitées par des moyens techniques.

Bien que les méthodes de recherche traditionnelles telles que l’immunohistochimie et les expériences de liaison aux radioligands puissent fournir des informations statiques sur la distribution des peptides opioïdes, elles sont difficiles à capturer le processus de libération dynamique et le modèle de distribution spatio-temporelle fin des peptides opioïdes dans le système nerveux vivant.

En particulier lors de l’exploration de la fonction des peptides opioïdes dans des circuits neuronaux spécifiques et de l’exploration des changements dynamiques de la libération des peptides opioïdes dans des états comportementaux complexes, les technologies existantes sont souvent insuffisantes.

Afin de surmonter les goulots d'étranglement ci-dessus, Dong Chunyang et ses collaborateurs ont développé cette stratégie de sonde fluorescente des récepteurs opioïdes basée sur le codage génétique.

Auparavant, le directeur de thèse de Dong Chunyang avait développé une sonde à ions calcium GCaMP3, capable d'utiliser la fluorescence pour analyser l'activité nerveuse cérébrale chez plusieurs espèces, apportant ainsi une contribution importante à la détection de l'activité neuronale avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Cela a également jeté une certaine base pour l’optimisation des sondes à ions calcium. Actuellement, la série GCaMP de sondes à ions calcium est largement utilisée dans le domaine des neurosciences.

Les réalisations ci-dessus de l'instructeur Dong Chunyang ont jeté les bases du développement de nouvelles sondes de neurotransmetteurs.

Sous la direction de son mentor, Dong Chunyang a participé ces dernières années à l'étude des sondes dopaminergiques décalées vers le rouge et a développé deux sondes de sérotonine et diverses autres sondes neuropeptidiques.

Parallèlement, Dong Chunyang a également collaboré avec l'équipe du professeur Li Yulong de l'Université de Pékin pour publier un article de synthèse sur le développement et l'application de sondes de neurotransmetteurs. Ces expériences lui ont permis d’acquérir des connaissances sur l’exploration de sondes peptidiques opioïdes plus complexes.

Sur cette base, Dong Chunyang a réalisé que le développement de sondes peptidiques opioïdes était confronté à des défis plus importants que les sondes de neurotransmetteurs développées précédemment.

La complexité du système peptidique opioïde, qui comprend plusieurs peptides opioïdes endogènes et plusieurs sous-types de récepteurs, rend particulièrement difficile le développement de sondes hautement spécifiques.

Et contrairement à d’autres sondes, il n’existe pas de formule toute faite à suivre pour le développement de sondes peptidiques opioïdes. Cela signifie que chaque variante de sonde doit être conçue individuellement et vérifiée une par une, ce qui augmente considérablement la charge de travail et la complexité.

Par exemple, il est nécessaire de trouver le site d’insertion et la séquence de connexion optimaux de la protéine fluorescente tout en maintenant la fonction du récepteur. Au cours de cette période, de nombreux travaux de biologie moléculaire ont été nécessaires, notamment la conception, la construction et le criblage de centaines de variantes différentes.

Au cours de la phase de caractérisation in vitro, chaque variante de sonde doit être soigneusement évaluée pour sa réponse aux différents peptides opioïdes et sous-types de récepteurs. Y compris la détermination détaillée de la plage dynamique, de la sensibilité, de la sélectivité et de la cinétique de réaction de la sonde.

Grâce à un grand nombre d'expériences de caractérisation in vitro, Dong Chunyang et d'autres ont sélectionné des variantes présentant une plage dynamique plus large, une sensibilité et une spécificité plus élevées.

Par la suite, ils ont effectué un travail de vérification autour de la spécificité de la sonde et ont utilisé la stimulation optogénétique du circuit BLA-NAc dans des expériences entre des souris knock-out pour la dynorphine et des souris sauvages pour prouver la spécificité de κLight pour le sexe de la dynorphine.

Cela garantit non seulement que la sonde peut toujours conserver sa spécificité et sa sensibilité dans des environnements neuronaux complexes, mais garantit également sa fiabilité lorsque les utilisateurs l'utilisent dans des conditions physiologiques.

(Source : Nature Neurosciences)

D'innombrables répétitions, échecs, optimisations et répétitions

Dong Chunyang a déclaré que l'un des objectifs de cette recherche est de caractériser de manière exhaustive les propriétés pharmacologiques de ces nouvelles sondes in vitro et dans des tranches de cerveau isolées.

Cela comprend la détermination de l'affinité, de la sélectivité et des caractéristiques cinétiques des sondes pour différents peptides opioïdes endogènes et synthétiques.

Après les avoir comparées aux expériences traditionnelles de liaison de radioligands, ils espèrent vérifier si ces sondes reflètent avec précision l’interaction des peptides opioïdes avec les récepteurs.

Dans le même temps, il est également nécessaire d'évaluer si l'expression de la sonde affectera le fonctionnement normal des récepteurs opioïdes endogènes afin de garantir sa valeur d'application dans des conditions physiologiques.

Le deuxième objectif de cette étude est d'utiliser ces sondes pour explorer les caractéristiques de diffusion des peptides opioïdes dans les tissus cérébraux.

Auparavant, on pensait que les peptides opioïdes agissent principalement par transport volumétrique. Cependant, les preuves directes de l’étendue et du rythme spécifiques de la diffusion font encore défaut.

À cette fin, le groupe de recherche a conçu une ingénieuse expérience de photolyse pour surveiller simultanément les changements dans les signaux de fluorescence en libérant des précurseurs de peptides opioïdes photosensibles, réalisant ainsi pour la première fois une observation en temps réel et une analyse quantitative du processus de diffusion des peptides opioïdes.

Grâce à cette expérience,Ils ont non seulement révélé la constante de diffusion des peptides opioïdes, mais ont également fourni une base importante pour comprendre l’étendue spatiale des signaux peptidiques opioïdes.

Le troisième objectif de cette étude était de déterminer les paramètres optimaux de stimulation électrique qui déclenchent la libération de peptides opioïdes endogènes, ce qui est essentiel pour étudier la fonction des peptides opioïdes in vivo.

En ajustant systématiquement l’intensité, la fréquence et la durée de la stimulation dans les tranches de cerveau, ainsi qu’en surveillant la réponse des sondes fluorescentes, l’équipe espère trouver le mode de stimulation le plus efficace, jetant ainsi une certaine base pour les expériences électrophysiologiques et optogénétiques.

Dans des expériences sur des animaux vivants, ils ont combiné ces sondes fluorescentes avec des techniques optogénétiques pour explorer la dynamique de la libération des peptides opioïdes dans des circuits neuronaux spécifiques.

Par exemple, en exprimant une sonde κLight dans le noyau accumbens et un canal ionique sensible à la lumière dans l’amygdale, l’activation de projections spécifiques peut être contrôlée avec précision et la libération de dynorphine endogène qui en résulte peut être observée en temps réel.

L’avantage de cette approche est qu’elle fournit non seulement une résolution temporelle et spatiale sans précédent, mais révèle également la spécificité spatiale de la libération des peptides opioïdes.

En outre, l'équipe de recherche a également mené les explorations suivantes : explorer les changements dynamiques dans la libération de peptides opioïdes dans des états comportementaux complexes, comme lors du conditionnement par la peur et de l'apprentissage par récompense.

En effectuant une photométrie à fibre optique sur des animaux en mouvement libre, Dong Chunyang et d'autres ont utilisé des sondes pour capturer les changements dans les signaux peptidiques opioïdes liés à des comportements spécifiques.

Il se souvient encore de la première fois où il a réussi à capturer le moment de libération du peptide opioïde endogène chez des souris vivantes. "Nous avons passé plusieurs années à optimiser la sonde et avons finalement confirmé une variante in vitro qui devrait être utilisée avec succès in vivo", a-t-il déclaré.

Plus précisément, ils ont emballé le plasmide κLight dans un virus adéno-associé. Après s’être familiarisés avec les coordonnées de la zone cérébrale de la souris, ils ont commencé l’injection intracrânienne du virus, puis ont attendu que la sonde soit exprimée dans le cerveau de la souris.

"Après d'innombrables répétitions, échecs, optimisations et répétitions, lorsque j'ai vu la sonde κLight sur l'écran de l'ordinateur d'enregistrement de la lumière au fur et à mesure que la stimulation conditionnée par la peur progressait, des pics de signaux lumineux ont commencé à apparaître les uns après les autres, ce qui m'a vraiment ému "Dong Chunyang. dit.

Cependant, la rationalité scientifique l'a rapidement fait reculer, et il a dû prouver que ce qu'il avait vu était le signal de dynorphine détecté par κLight et non d'autres artefacts.

Après avoir prouvé la reproductibilité du phénomène ci-dessus sur plusieurs souris, l'équipe de recherche a conçu différentes expériences, notamment des expériences optogénétiques utilisant des souris knock-out à la dynorphine, pour prouver qu'en l'absence de dynorphine et de la même stimulation, l'équipe de recherche aucun signal n'apparaît de l'aiguille, démontrant ainsi l’exactitude et la spécificité de la sonde.

Finalement, lorsque chaque expérience a pointé vers un résultat avec une forte spécificité et un rapport signal/bruit élevé, chacun a finalement lâché son suspense.

(Source : Nature Neurosciences)

Enfin, l'article connexe a été publié dans Nature Neuroscience (IF 21.2) sous le titre « Déverrouillage de la dynamique des neuropeptides opioïdes avec des biocapteurs génétiquement codés ».

Figure | Articles connexes (Source : Nature Neuroscience)

Dong Chunyang et Raajaram Gowrishankar de l'Université de Washington sont co-auteurs.

Le professeur Michael R. Bruchas de l'Université de Washington, le professeur Matthew R. Banghart de l'Université de Californie à San Diego et le professeur Tian Lin du Max Planck Florida Neuroscience Institute sont les auteurs co-correspondants.

Grâce à cette réalisation, Dong Chunyang a remporté le prix Toni Shippenberg du jeune chercheur des National Institutes of Health.

En termes de perspectives d’application :

Premièrement, il peut être utilisé dans la recherche fondamentale en neurosciences.

La sonde fluorescente des récepteurs opioïdes créée cette fois permettra aux gens d'observer et de mesurer plus précisément les changements dynamiques des peptides opioïdes dans le système nerveux, contribuant ainsi à révéler le rôle spécifique du système opioïde dans divers processus neuronaux, tels que la révélation du rôle de apprentissage, effet mémoire, effet de régulation des émotions, etc.

Deuxièmement, il peut être utilisé pour la recherche sur la douleur.

Dans la modulation de la douleur, le système opioïde joue un rôle clé. Par conséquent, cette sonde devrait être utilisée pour étudier les modèles de libération de peptides opioïdes dans les états de douleur aiguë et les états de douleur chronique, contribuant ainsi à développer des stratégies de gestion de la douleur plus efficaces.

Troisièmement, elle peut être utilisée pour étudier les mécanismes de la dépendance.

En surveillant en temps réel l’activité des peptides opioïdes dans les circuits de récompense, nous pourrons peut-être mieux comprendre les bases neurobiologiques de la toxicomanie et fournir des indices pour le développement de nouveaux traitements.

Quatrièmement, il peut être utilisé pour le développement et le dépistage de médicaments.

Autrement dit, cette sonde peut être utilisée pour le criblage à haut débit afin d’aider à identifier de nouveaux modulateurs des récepteurs opioïdes, contribuant ainsi à développer des médicaments analgésiques plus sûrs et plus efficaces.

Cinquièmement, il peut être utilisé dans la recherche sur les troubles de l’humeur.

Compte tenu de la relation étroite entre le système opioïde et la régulation des émotions, cette sonde devrait être utilisée pour étudier les mécanismes neuronaux de la dépression, de l'anxiété et d'autres troubles de l'humeur.

Sixièmement, il peut être utilisé pour des applications de neuroimagerie.

Lorsque ces sondes seront modifiées, elles devraient être utilisées dans des techniques d'imagerie cérébrale non invasives pour observer l'activité du système opioïde dans le cerveau humain.

Septièmement, il peut être utilisé pour développer une technologie de neuromodulation.

Associées à l'optogénétique ou à la génétique chimique, ces sondes devraient permettre de développer des techniques de neuromodulation plus précises pour traiter les maladies liées au système opioïde.

Huitièmement, il peut être utilisé dans la recherche en neurosciences comportementales.

Autrement dit, il est utilisé pour étudier le rôle du système opioïde dans les fonctions cognitives avancées telles que le comportement social complexe et la prise de décision.

Neuf, il peut être utilisé pour prévenir l’abus de drogues.

Une meilleure compréhension du fonctionnement du système opioïde pourrait aider à développer des stratégies de prévention de l’abus de drogues et des méthodes éducatives plus efficaces.

Dixièmement, il peut être utilisé pour la médecine personnalisée.

En étudiant les différences dans la réponse du système opioïde chez différents individus dans des modèles animaux, cela peut fournir une base théorique pour un traitement individualisé de la douleur et une gestion de la dépendance.

Prises ensemble, ces applications potentielles devraient non seulement faire progresser la recherche fondamentale en neurosciences, mais pourraient également avoir un impact significatif sur la médecine clinique, le développement de médicaments et les politiques de santé publique.

Bien entendu, il faudra de nombreuses années de recherche et de vérification pour passer de la recherche fondamentale aux applications pratiques.

Et à l'avenir :

Premièrement, les performances des sondes existantes seront améliorées.

C’est-à-dire améliorer la spécificité, la sensibilité, la plage dynamique et les propriétés cinétiques des sondes neuropeptidiques existantes.

Cela peut impliquer des stratégies d’ingénierie des protéines plus complexes, telles que l’évolution dirigée assistée par l’IA, la conception rationnelle guidée par la biologie structurale, etc.

Deuxièmement, des sondes fluorescentes ciblant davantage de neuropeptides seront développées.

C’est-à-dire étendre l’expérience existante à d’autres systèmes neuropeptidiques, neurotransmetteurs et neuromodulateurs.

Troisièmement, combinez les sondes existantes avec d’autres techniques d’imagerie.

Par exemple, la combinaison de sondes neuropeptidiques avec une microscopie à super-résolution ou une microscopie miniaturisée à deux photons devrait permettre d’observer la dynamique de libération des neuropeptides au niveau subcellulaire ou chez des animaux en mouvement libre.

Dans le même temps, grâce à la technologie d’imagerie multicolore, les gens peuvent observer simultanément la dynamique de plusieurs neuropeptides ou neurotransmetteurs, révélant ainsi les interactions entre eux.

Enfin, l’application de ces sondes ne se limite pas à la recherche fondamentale, mais pourrait également s’étendre au domaine du développement de médicaments, c’est-à-dire développer des plateformes de criblage à haut débit pour aider à découvrir de nouveaux médicaments neuropsychiatriques.

Pour les sondes neuropeptidiques, il continuera également à promouvoir le développement de la recherche en neurosciences vers une résolution spatio-temporelle plus élevée, une diversité moléculaire plus large et des paradigmes comportementaux plus complexes, apportant ainsi un soutien à la compréhension du fonctionnement cérébral et au développement de nouvelles stratégies de traitement.

Références :

1. Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y. et al. Décrypter la dynamique des neuropeptides opioïdes grâce à des biocapteurs génétiquement codés. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

Opération/composition : He Chenlong

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