новости

한어Русский языкEnglishFrançaisIndonesianSanskrit日本語DeutschPortuguêsΕλληνικάespañolItalianoSuomalainenLatina

Недавно Донг Чуньянг, аспирант Калифорнийского университета в Дэвисе и в настоящее время занимающийся постдокторскими исследованиями в Стэнфордском университете, совместно разработал новый генетически кодируемый флуоресцентный зонд, который представляет собой инновационный инструмент для изучения динамики нейропептидов.

Изображение | Донг Чуньян (Источник: Донг Чуньян)

По сообщениям,Основная идея этого исследования состоит в том, чтобы объединить флуоресцентные белки с опиоидными рецепторами и отразить процесс связывания опиоидных пептидов в реальном времени через изменения сигналов флуоресценции, вызванные изменениями конформации рецептора.

В течение этого периода Донг Чуньянг и другие разработали соответствующие флуоресцентные зонды κLight, δLight и µLight соответственно для трех основных подтипов опиоидных рецепторов - κ-рецептора, δ-рецептора и μ-рецептора.

Таким образом, можно не только различать различные типы опиоидных пептидов, но и достигать обнаружения сигналов с высоким пространственно-временным разрешением на уровне отдельных клеток.

(Источник: Природная неврология)

Благодаря разработке и применению новых флуоресцентных зондов это исследование направлено на глубокое изучение функций и регуляторных механизмов опиоидной пептидной системы на нескольких уровнях.

Это не только поможет людям понять роль опиоидной системы в эмоциональном и мотивационном поведении, но также может дать новый взгляд на понимание и лечение связанных с ними психических заболеваний.

Ожидается, что это достижение, изучающее взаимодействия рецептора и лиганда на молекулярном уровне, передачу сигналов на клеточном и контурном уровнях, а также функциональную регуляцию на общем поведенческом уровне, принесет революционный прогресс в изучении опиоидной системы.

Это делает важный шаг на пути к лучшему пониманию эндогенной опиоидной системы и предоставляет ценный новый инструмент для изучения опиоидной пептидной системы.

Зонды на эндогенные и синтетические опиоиды являются отличным дополнением к нынешнему «набору инструментов» нейробиологии и могут привести к улучшению пространственно-временной выборки сигналов опиоидов.

Это не только будет способствовать развитию фундаментальных исследований в области нейробиологии, но и откроет новые перспективы для клинических применений, таких как обезболивание и лечение наркозависимости.

(Источник: Природная неврология)

Начнем со «статуса» опиоидных нейропептидов.

По имеющимся данным, в области нейробиологии опиоидная нейропептидная система занимает центральное положение.

В качестве ключевого нейромодулирующего вещества опиоидные пептиды играют незаменимую роль в регулировании множества физиологических и патологических процессов, таких как восприятие боли, поведение вознаграждения, эмоциональные реакции и зависимость.

Однако углубленные исследования эндогенной опиоидной пептидной системы долгое время были ограничены техническими средствами.

Хотя традиционные методы исследования, такие как иммуногистохимия и эксперименты по связыванию радиолигандов, могут предоставить информацию о статическом распределении опиоидных пептидов, они трудно уловить процесс динамического высвобождения и точную пространственно-временную картину распределения опиоидных пептидов в живой нервной системе.

Существующие технологии часто оказываются недостаточными, особенно при изучении функции опиоидных пептидов в конкретных нейронных цепях и изучении динамических изменений высвобождения опиоидных пептидов в сложных поведенческих состояниях.

Чтобы преодолеть вышеуказанные узкие места, Донг Чуньянг и его коллеги разработали стратегию флуоресцентных зондов опиоидных рецепторов, основанную на генетическом кодировании.

Ранее научный руководитель Донг Чуньяна разработал зонд ионов кальция GCaMP3, который может использовать флуоресценцию для анализа активности нервов головного мозга у нескольких видов животных, внося важный вклад в обнаружение нейронной активности с высоким пространственным и временным разрешением.

Это также заложило определенную основу для оптимизации зондов ионов кальция. В настоящее время серия зондов ионов кальция GCaMP широко используется в области нейробиологии.

Вышеуказанные достижения инструктора Донг Чуньяна заложили основу для разработки новых нейромедиаторных зондов.

Под руководством своего наставника Донг Чуньян в последние несколько лет участвовал в исследовании дофаминовых зондов со смещением в красную область и разработал два серотониновых зонда и различные другие нейропептидные зонды.

В то же время Донг Чуньян также сотрудничал с командой профессора Ли Юлонга из Пекинского университета, чтобы опубликовать обзорный доклад о разработке и применении нейромедиаторных зондов. Этот опыт дал ему понимание того, как исследовать более сложные опиоидные пептидные зонды.

На этом основании Донг Чуньян понял, что разработка зондов опиоидных пептидов столкнулась с более серьезными проблемами, чем ранее разработанные зонды нейромедиаторов.

Сложность системы опиоидных пептидов, которая включает множество эндогенных опиоидных пептидов и множество подтипов рецепторов, особенно затрудняет разработку высокоспецифичных зондов.

И в отличие от других зондов, не существует готовой формулы для разработки зондов на основе опиоидных пептидов. Это означает, что каждый вариант зонда необходимо разрабатывать индивидуально и проверять один за другим, что значительно увеличивает рабочую нагрузку и сложность.

Например, необходимо найти оптимальное место внедрения флуоресцентного белка и последовательность соединения при сохранении функции рецептора. В этот период была проведена большая работа в области молекулярной биологии, включая проектирование, создание и проверку сотен различных вариантов.

На этапе характеристики in vitro необходимо тщательно оценить каждый вариант зонда на предмет его реакции на различные опиоидные пептиды и подтипы рецепторов. Включая детальное определение динамического диапазона, чувствительности, селективности и кинетики реакции зонда.

Посредством большого количества экспериментов по определению характеристик in vitro Донг Чуньянг и другие отобрали варианты с более широким динамическим диапазоном, более высокой чувствительностью и более высокой специфичностью.

Впоследствии они провели работу по проверке специфичности зонда и использовали оптогенетическую стимуляцию цепи BLA-NAc в экспериментах между мышами, нокаутными по динорфину, и мышами дикого типа, чтобы доказать специфичность κLight для секса с динорфином.

Это не только гарантирует сохранение специфичности и чувствительности зонда в сложной нейронной среде, но также обеспечивает надежность зонда, когда пользователи используют его в физиологических условиях.

(Источник: Природная неврология)

Бесчисленные повторения, неудачи, оптимизации и повторения.

Донг Чуньянг сказал, что одна из целей этого исследования — всесторонне охарактеризовать фармакологические свойства этих новых зондов in vitro и в изолированных срезах мозга.

Это включает определение аффинности, селективности и кинетических характеристик зондов для различных эндогенных и синтетических опиоидных пептидов.

Сравнив их с традиционными экспериментами по связыванию радиолигандов, они надеются проверить, точно ли эти зонды отражают взаимодействие опиоидных пептидов с рецепторами.

В то же время необходимо также оценить, повлияет ли экспрессия зонда на нормальную функцию эндогенных опиоидных рецепторов, чтобы обеспечить ценность его применения в физиологических условиях.

Вторая цель этого исследования — использовать эти зонды для изучения диффузионных характеристик опиоидных пептидов в тканях головного мозга.

Ранее считалось, что опиоидные пептиды действуют преимущественно за счет объемного транспорта. Однако прямые доказательства конкретных масштабов и скорости распространения все еще отсутствуют.

С этой целью исследовательская группа разработала гениальный эксперимент по фотолизу для одновременного мониторинга изменений сигналов флуоресценции путем высвобождения фоточувствительных предшественников опиоидных пептидов, тем самым впервые добившись наблюдения в реальном времени и количественного анализа процесса диффузии опиоидных пептидов.

Благодаря этому эксперименту,Они не только выявили константу диффузии опиоидных пептидов, но и предоставили важную основу для понимания пространственной протяженности сигналов опиоидных пептидов.

Третьей целью этого исследования было определение оптимальных параметров электростимуляции, которые запускают высвобождение эндогенных опиоидных пептидов, что имеет решающее значение для изучения функции опиоидных пептидов in vivo.

Систематически регулируя интенсивность стимуляции, частоту стимуляции и продолжительность стимуляции на срезах мозга, а также отслеживая реакцию флуоресцентных зондов, команда надеется найти наиболее эффективный режим стимуляции, заложив тем самым определенную основу для электрофизиологических экспериментов и оптогенетических экспериментов.

В экспериментах на живых животных они объединили эти флуоресцентные зонды с оптогенетическими методами, чтобы изучить динамику высвобождения опиоидных пептидов в определенных нервных цепях.

Например, экспрессируя зонд κLight в прилежащем ядре и светочувствительный ионный канал в миндалевидном теле, можно точно контролировать активацию определенных проекций и наблюдать в реальном времени возникающее в результате высвобождение эндогенного динорфина.

Преимущество этого подхода заключается в том, что он не только обеспечивает беспрецедентное временное и пространственное разрешение, но также выявляет пространственную специфичность высвобождения опиоидных пептидов.

Кроме того, исследовательская группа также провела следующие исследования: изучение динамических изменений высвобождения опиоидных пептидов в сложных поведенческих состояниях, например, во время обусловления страха и обучения с помощью вознаграждения.

Проводя оптоволоконную фотометрию у свободно движущихся животных, Донг Чуньянг и другие использовали зонды для регистрации изменений в сигналах опиоидных пептидов, связанных с конкретным поведением.

Он до сих пор помнит, как впервые ему удалось запечатлеть момент высвобождения эндогенного опиоидного пептида у живых мышей. «Мы потратили несколько лет на оптимизацию зонда и, наконец, подтвердили вариант in vitro, который, как ожидается, будет успешно использоваться in vivo», — сказал он.

В частности, они упаковали плазмиду κLight в аденоассоциированный вирус. Ознакомившись с координатами области мозга мыши, они начали внутричерепную инъекцию вируса, а затем ждали, пока зонд будет экспрессирован в мозге мыши.

«После бесчисленных повторений, неудач, оптимизаций и повторений, когда я увидел датчик κLight на экране светозаписывающего компьютера по мере прогрессирования стимуляции обусловливания страхом, яркие пики сигнала начали появляться один за другим, что меня очень тронуло», — Донг Чуньян. сказал.

Однако научная рациональность быстро оттолкнула его назад, и ему пришлось доказывать, что то, что он видел, было сигналом динорфина, обнаруженным κLight, а не другими артефактами.

Доказав воспроизводимость вышеупомянутого явления на нескольких мышах, исследовательская группа разработала различные эксперименты, особенно оптогенетические эксперименты с использованием мышей, нокаутированных по динорфину, чтобы доказать, что в отсутствие динорфина и той же стимуляции исследовательская группа не получает сигнала от иглы. тем самым демонстрируя точность и специфичность зонда.

Наконец, когда каждый эксперимент показал результат с высокой специфичностью и высоким соотношением сигнал/шум, все наконец отпустили напряжение.

(Источник: Природная неврология)

Наконец, соответствующая статья была опубликована в журнале Nature Neuroscience (IF 21.2) под названием «Разблокирование динамики опиоидных нейропептидов с помощью генетически закодированных биосенсоров».

Рисунок | Похожие статьи (Источник: Nature Neuroscience)

Соавторы — Донг Чуньянг и Раджарам Говришанкар из Вашингтонского университета.

Профессор Майкл Р. Бручас из Вашингтонского университета, профессор Мэтью Р. Бангхарт из Калифорнийского университета в Сан-Диего и профессор Тиан Лин из Флоридского института нейробиологии им. Макса Планка выступают в качестве соавтора.

Благодаря этому достижению Донг Чуньян получил Премию молодого исследователя Тони Шиппенберга от Национального института здравоохранения.

По перспективам применения:

Во-первых, его можно использовать в фундаментальных нейробиологических исследованиях.

Созданный на этот раз флуоресцентный зонд опиоидного рецептора позволит людям более точно наблюдать и измерять динамические изменения опиоидных пептидов в нервной системе, тем самым помогая выявить специфическую роль опиоидной системы в различных нервных процессах, например, выявить роль обучение, эффект памяти, эффект регулирования эмоций и т. д.

Во-вторых, его можно использовать для исследования боли.

В модуляции боли ключевую роль играет опиоидная система. Таким образом, ожидается, что этот зонд будет использоваться для изучения закономерностей высвобождения опиоидных пептидов при состояниях острой и хронической боли, тем самым помогая разработать более эффективные стратегии управления болью.

В-третьих, его можно использовать для изучения механизмов зависимости.

Мониторинг активности опиоидных пептидов в цепях вознаграждения в режиме реального времени позволит нам лучше понять нейробиологическую основу наркозависимости и дать ключ к разработке новых методов лечения.

В-четвертых, его можно использовать для разработки и проверки лекарств.

То есть этот зонд можно использовать для высокопроизводительного скрининга, чтобы помочь идентифицировать новые модуляторы опиоидных рецепторов, тем самым помогая разрабатывать более безопасные и более эффективные анальгетики.

В-пятых, его можно использовать в исследованиях расстройств настроения.

Учитывая тесную связь между опиоидной системой и регуляцией эмоций, ожидается, что этот зонд будет использоваться для изучения нейронных механизмов расстройств настроения, таких как депрессия и тревога.

В-шестых, его можно использовать для нейровизуализации.

Ожидается, что когда эти зонды будут модифицированы, их можно будет использовать в неинвазивных методах визуализации мозга для наблюдения за активностью опиоидной системы в человеческом мозге.

В-седьмых, его можно использовать для разработки технологии нейромодуляции.

Ожидается, что в сочетании с оптогенетикой или химической генетикой эти исследования помогут разработать более точные методы нейромодуляции для лечения заболеваний, связанных с опиоидной системой.

В-восьмых, его можно использовать в исследованиях поведенческой нейробиологии.

То есть он используется для изучения роли опиоидной системы в расширенных когнитивных функциях, таких как сложное социальное поведение и принятие решений.

В-девятых, его можно использовать для предотвращения злоупотребления наркотиками.

Более глубокое понимание функций опиоидной системы может помочь разработать более эффективные стратегии профилактики злоупотребления наркотиками и образовательные методы.

В-десятых, его можно использовать для персонализированной медицины.

Изучая различия в реакции опиоидной системы у разных людей на животных моделях, можно создать теоретическую основу для индивидуального лечения боли и борьбы с зависимостью.

Ожидается, что в совокупности эти потенциальные приложения не только продвинут фундаментальные исследования в области нейробиологии, но также могут оказать существенное влияние на клиническую медицину, разработку лекарств и политику общественного здравоохранения.

Конечно, потребуются многие годы исследований и проверок, чтобы перейти от фундаментальных исследований к практическому применению.

И в будущем:

Во-первых, будут улучшены характеристики существующих зондов.

То есть улучшение специфичности, чувствительности, динамического диапазона и кинетических свойств существующих нейропептидных зондов.

Это может включать в себя более сложные стратегии белковой инженерии, такие как направленная эволюция с помощью ИИ, рациональный дизайн, основанный на структурной биологии, и т. д.

Во-вторых, будут разработаны флуоресцентные зонды, нацеленные на большее количество нейропептидов.

То есть распространение существующего опыта на другие нейропептидные системы, нейротрансмиттеры и нейромодуляторы.

В-третьих, объединить существующие зонды с другими методами визуализации.

Например, ожидается, что сочетание нейропептидных зондов с микроскопией сверхвысокого разрешения или миниатюрной двухфотонной микроскопией позволит людям наблюдать динамику высвобождения нейропептидов на субклеточном уровне или у свободно перемещающихся животных.

В то же время с помощью технологии многоцветной визуализации люди смогут наблюдать динамику нескольких нейропептидов или нейротрансмиттеров одновременно, выявляя тем самым взаимодействие между ними.

Наконец, применение этих зондов не ограничивается фундаментальными исследованиями, но также имеет потенциал расширения в область разработки лекарств, то есть для разработки платформ высокопроизводительного скрининга, которые помогут обнаружить новые нейропсихиатрические препараты.

Что касается нейропептидных зондов, он также будет продолжать способствовать развитию нейробиологических исследований в направлении более высокого пространственно-временного разрешения, более широкого молекулярного разнообразия и более сложных поведенческих парадигм, обеспечивая поддержку для понимания функций мозга и разработки новых стратегий лечения.

Ссылки:

1.Донг, К., Гоуришанкар, Р., Джин, Й. и др. Раскрытие динамики опиоидных нейропептидов с помощью генетически кодируемых биосенсоров. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

Операция/набор: Хэ Ченлун

01/

02/

03/

04/

05/