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Recentemente, Dong Chunyang, doutorado direto pela Universidade da Califórnia, Davis, e atualmente envolvido em pesquisa de pós-doutorado na Universidade de Stanford, desenvolveu em conjunto uma nova sonda fluorescente geneticamente codificada, que fornece uma ferramenta inovadora para o estudo da dinâmica dos neuropeptídeos.

Foto | Dong Chunyang (Fonte: Dong Chunyang)

Segundo relatos,A ideia central deste estudo é fundir proteínas fluorescentes com receptores opióides e refletir o processo de ligação dos peptídeos opióides em tempo real por meio de alterações nos sinais de fluorescência causadas por alterações na conformação do receptor.

Durante este período, Dong Chunyang e outros projetaram sondas fluorescentes correspondentes κLight, δLight e μLight, respectivamente, para os três principais subtipos de receptores opióides - receptor κ, receptor δ e receptor μ.

Desta forma, não só podem ser distinguidos diferentes tipos de péptidos opióides, mas a detecção de sinal com elevada resolução espaço-temporal pode ser conseguida ao nível de uma única célula.

(Fonte: Neurociência da Natureza)

Através do desenvolvimento e aplicação de novas sondas fluorescentes, este estudo visa explorar profundamente as funções e mecanismos regulatórios do sistema peptídico opioide em múltiplos níveis.

Isto não só ajudará as pessoas a compreender o papel do sistema opioide no comportamento emocional e motivacional, mas também poderá fornecer novos insights sobre a compreensão e o tratamento de doenças mentais relacionadas.

Ao estudar as interações receptor-ligante no nível molecular, a sinalização nos níveis celular e de circuito e a regulação funcional no nível comportamental geral, espera-se que esta conquista traga um progresso revolucionário ao estudo do sistema opióide.

É um passo importante para uma melhor compreensão do sistema opioide endógeno e fornece uma nova ferramenta valiosa para o estudo do sistema peptídico opioide.

Sondas para opióides endógenos e sintéticos são um ótimo complemento para a atual “caixa de ferramentas” da neurociência e podem levar a uma melhor amostragem espaço-temporal da sinalização de opióides.

Isto não só promoverá o desenvolvimento da investigação básica em neurociências, mas também abrirá novas perspectivas para aplicações clínicas, como o tratamento da dor e o tratamento da dependência.

(Fonte: Neurociência da Natureza)

Vamos começar com o “status” dos neuropeptídeos opioides

Segundo relatos, no campo da neurociência, o sistema neuropeptídico opioide ocupa uma posição central.

Como substância neuromoduladora chave, os peptídeos opioides desempenham um papel indispensável na regulação de múltiplos processos fisiológicos e patológicos, como percepção da dor, comportamento de recompensa, resposta emocional e dependência.

No entanto, a investigação aprofundada sobre o sistema peptídico opióide endógeno tem sido limitada por meios técnicos há muito tempo.

Embora os métodos de pesquisa tradicionais, como imuno-histoquímica e experimentos de ligação de radioligantes, possam fornecer informações estáticas sobre a distribuição de peptídeos opióides, eles são difíceis de capturar o processo de liberação dinâmica e o padrão fino de distribuição espaço-temporal dos peptídeos opióides no sistema nervoso vivo.

Especialmente ao explorar a função dos peptídeos opióides em circuitos neurais específicos e explorar as mudanças dinâmicas da liberação de peptídeos opióides sob estados comportamentais complexos, as tecnologias existentes são frequentemente insuficientes.

A fim de romper os gargalos acima, Dong Chunyang e seus colaboradores desenvolveram esta estratégia de sonda fluorescente para receptores de opióides baseada na codificação genética.

Anteriormente, o orientador de doutorado de Dong Chunyang havia desenvolvido uma sonda de íons de cálcio GCaMP3, que pode usar fluorescência para analisar a atividade nervosa cerebral em múltiplas espécies, dando uma contribuição importante para a detecção de atividade neural com alta resolução espacial e temporal.

Ele também estabeleceu uma certa base para a otimização de sondas de íons de cálcio. Atualmente, a série GCaMP de sondas de íons de cálcio tem sido amplamente utilizada no campo da neurociência.

As conquistas acima do instrutor Dong Chunyang lançaram as bases para o desenvolvimento de novas sondas de neurotransmissores.

Sob a orientação de seu mentor, Dong Chunyang participou do estudo de sondas de dopamina com desvio para o vermelho nos últimos anos e desenvolveu duas sondas de serotonina e várias outras sondas de neuropeptídeos.

Ao mesmo tempo, Dong Chunyang também colaborou com a equipe do professor Li Yulong da Universidade de Pequim para publicar um artigo de revisão sobre o desenvolvimento e aplicação de sondas de neurotransmissores. Essas experiências forneceram-lhe insights sobre a exploração de sondas peptídicas opioides mais complexas.

Nesta base, Dong Chunyang percebeu que o desenvolvimento de sondas peptídicas opióides enfrentava desafios maiores do que as sondas de neurotransmissores desenvolvidas anteriormente.

A complexidade do sistema peptídico opioide, que inclui múltiplos peptídeos opioides endógenos e múltiplos subtipos de receptores, torna particularmente difícil o desenvolvimento de sondas altamente específicas.

E, ao contrário de outras sondas, não existe uma fórmula pronta a seguir para o desenvolvimento de sondas peptídicas opióides. Isso significa que cada variante de teste precisa ser projetada individualmente e verificada uma por uma, o que aumenta muito a carga de trabalho e a complexidade.

Por exemplo, é necessário encontrar o local ideal de inserção da proteína fluorescente e a sequência de conexão, mantendo a função do receptor. Durante este período, muito trabalho de biologia molecular esteve envolvido, incluindo a concepção, construção e triagem de centenas de variantes diferentes.

Durante a fase de caracterização in vitro, cada variante da sonda precisa ser cuidadosamente avaliada quanto à sua resposta a diferentes peptídeos opióides e subtipos de receptores. Incluindo determinação detalhada da faixa dinâmica, sensibilidade, seletividade e cinética de reação da sonda.

Através de um grande número de experimentos de caracterização in vitro, Dong Chunyang e outros selecionaram variantes com maior faixa dinâmica, maior sensibilidade e maior especificidade.

Posteriormente, eles realizaram trabalhos de verificação em torno da especificidade da sonda e usaram estimulação optogenética do circuito BLA-NAc em experimentos entre camundongos knockout para dinorfina e camundongos do tipo selvagem para provar a especificidade de κLight para sexo com dinorfina.

Isso não apenas garante que a sonda ainda possa manter a especificidade e a sensibilidade em ambientes neurais complexos, mas também garante a confiabilidade da sonda quando os usuários a utilizam em condições fisiológicas.

(Fonte: Neurociência da Natureza)

Inúmeras repetições, falhas, otimizações e repetições

Dong Chunyang disse que um dos objetivos desta pesquisa é caracterizar de forma abrangente as propriedades farmacológicas destas novas sondas in vitro e em fatias cerebrais isoladas.

Isto inclui a determinação da afinidade, seletividade e características cinéticas das sondas para diferentes peptídeos opióides endógenos e sintéticos.

Depois de compará-los com experimentos tradicionais de ligação de radioligantes, eles esperam verificar se essas sondas refletem com precisão a interação dos peptídeos opióides com os receptores.

Ao mesmo tempo, também é necessário avaliar se a expressão da sonda afetará a função normal dos receptores opióides endógenos para garantir o seu valor de aplicação em condições fisiológicas.

O segundo objetivo deste estudo é usar essas sondas para explorar as características de difusão dos peptídeos opioides no tecido cerebral.

Anteriormente, acreditava-se que os peptídeos opióides funcionavam principalmente através do transporte volumétrico. No entanto, ainda faltam evidências diretas da extensão e taxa específicas de difusão.

Para este fim, o grupo de pesquisa projetou um engenhoso experimento de fotólise para monitorar simultaneamente as mudanças nos sinais de fluorescência, liberando precursores de peptídeos opióides fotossensíveis, alcançando assim a observação em tempo real e a análise quantitativa do processo de difusão de peptídeos opióides pela primeira vez.

Através deste experimento,Eles não apenas revelaram a constante de difusão dos peptídeos opióides, mas também forneceram uma base importante para a compreensão da extensão espacial dos sinais dos peptídeos opióides.

O terceiro objetivo deste estudo foi determinar os parâmetros ideais de estimulação elétrica que desencadeiam a liberação de peptídeos opióides endógenos, o que é crítico para estudar a função dos peptídeos opióides in vivo.

Ao ajustar sistematicamente a intensidade de estimulação, a frequência de estimulação e a duração da estimulação em fatias cerebrais, bem como monitorar a resposta de sondas fluorescentes, a equipe espera encontrar o modo de estimulação mais eficaz, estabelecendo assim uma certa base para experimentos eletrofisiológicos e experimentos optogenéticos.

Em experimentos com animais vivos, eles combinaram essas sondas fluorescentes com técnicas optogenéticas para explorar a dinâmica da liberação de peptídeos opioides em circuitos neurais específicos.

Por exemplo, ao expressar uma sonda κLight no núcleo accumbens e um canal iônico sensível à luz na amígdala, a ativação de projeções específicas pode ser controlada com precisão e a liberação endógena de dinorfina resultante pode ser observada em tempo real.

O benefício desta abordagem é que ela não apenas fornece resolução temporal e espacial sem precedentes, mas também revela a especificidade espacial da liberação de peptídeos opióides.

Além disso, a equipe de pesquisa também conduziu as seguintes explorações: explorar as mudanças dinâmicas na liberação de peptídeos opioides sob estados comportamentais complexos, como durante o condicionamento do medo e a aprendizagem da recompensa.

Ao realizar fotometria de fibra óptica em animais em movimento livre, Dong Chunyang e outros usaram sondas para capturar mudanças nos sinais de peptídeos opióides relacionados a comportamentos específicos.

Ele ainda se lembra da primeira vez que capturou com sucesso o momento da liberação endógena do peptídeo opioide em camundongos vivos. “Passamos vários anos otimizando a sonda e finalmente confirmamos uma variante in vitro que deverá ser usada com sucesso in vivo”, disse ele.

Especificamente, eles empacotaram o plasmídeo κLight em um vírus adeno-associado. Depois de se familiarizarem com as coordenadas da área do cérebro do camundongo, eles iniciaram a injeção intracraniana do vírus e então esperaram que a sonda fosse expressa no cérebro do camundongo.

“Depois de inúmeras repetições, falhas, otimizações e repetições, quando vi a sonda κLight na tela do computador de gravação de luz à medida que a estimulação do condicionamento do medo progredia, picos de sinais brilhantes começaram a aparecer um após o outro, o que realmente me emocionou "Dong Chunyang. disse.

No entanto, a racionalidade científica rapidamente o puxou de volta, e ele teve que provar que o que viu foi o sinal de dinorfina detectado pela κLight e não por outros artefatos.

Depois de provar a reprodutibilidade do fenômeno acima através de vários camundongos, a equipe de pesquisa projetou diferentes experimentos, especialmente experimentos optogenéticos usando camundongos knockout para dinorfina, para provar que na ausência de dinorfina e a mesma estimulação, a equipe de pesquisa Nenhum sinal aparece da agulha, demonstrando assim a precisão e especificidade da sonda.

Finalmente, quando cada experimento apontou para um resultado com forte especificidade e alta relação sinal-ruído, todos finalmente abandonaram o suspense.

(Fonte: Neurociência da Natureza)

Finalmente, o artigo relacionado foi publicado na Nature Neuroscience (IF 21.2) com o título "Desbloqueando a dinâmica do neuropeptídeo opioide com biossensores geneticamente codificados".

Figura Artigos relacionados (Fonte: Nature Neuroscience)

Dong Chunyang e Raajaram Gowrishankar, da Universidade de Washington, são coautores.

Professor Michael R. Bruchas da Universidade de Washington, Professor Matthew R. Banghart da Universidade da Califórnia, San Diego, e Professor Tian Lin do Max Planck Florida Neuroscience Institute Servem como co-autores correspondentes.

Com esta conquista, Dong Chunyang ganhou o prêmio Toni Shippenberg Young Investigator Award dos Institutos Nacionais de Saúde.

Em termos de perspectivas de aplicação:

Primeiro, pode ser usado em pesquisas básicas em neurociência.

A sonda fluorescente do receptor opióide criada desta vez permitirá que as pessoas observem e meçam com mais precisão as mudanças dinâmicas dos peptídeos opióides no sistema nervoso, ajudando assim a revelar o papel específico do sistema opióide em vários processos neurais, como revelar o papel de aprendizagem, efeito de memória, efeito de regulação emocional, etc.

Em segundo lugar, pode ser usado para pesquisas sobre dor.

Na modulação da dor, o sistema opioide desempenha um papel fundamental. Portanto, espera-se que esta sonda seja usada para estudar os padrões de liberação de peptídeos opioides em estados de dor aguda e em estados de dor crônica, ajudando assim a desenvolver estratégias mais eficazes de controle da dor.

Terceiro, pode ser usado para estudar mecanismos de dependência.

Ao monitorar a atividade dos peptídeos opioides nos circuitos de recompensa em tempo real, poderemos compreender melhor a base neurobiológica da dependência de drogas e fornecer pistas para o desenvolvimento de novos tratamentos.

Quarto, pode ser usado para desenvolvimento e triagem de medicamentos.

Ou seja, esta sonda pode ser usada para triagem de alto rendimento para ajudar a identificar novos moduladores de receptores opióides, ajudando assim a desenvolver medicamentos analgésicos mais seguros e eficazes.

Quinto, pode ser usado em pesquisas sobre transtornos de humor.

Tendo em conta a estreita relação entre o sistema opióide e a regulação emocional, espera-se que esta sonda seja utilizada para estudar os mecanismos neurais da depressão, ansiedade e outros transtornos de humor.

Sexto, pode ser usado para aplicações de neuroimagem.

Quando essas sondas forem modificadas, espera-se que sejam usadas em técnicas de imagem cerebral não invasivas para observar a atividade do sistema opioide no cérebro humano.

Sétimo, pode ser usado para desenvolver tecnologia de neuromodulação.

Combinadas com a optogenética ou a genética química, espera-se que essas sondas ajudem a desenvolver técnicas de neuromodulação mais precisas para o tratamento de doenças relacionadas ao sistema opióide.

Oitavo, pode ser usado em pesquisas em neurociência comportamental.

Ou seja, é utilizado para estudar o papel do sistema opioide em funções cognitivas avançadas, como comportamento social complexo e tomada de decisões.

Nove, pode ser usado para prevenir o abuso de drogas.

Obter uma compreensão mais profunda da função do sistema opioide poderia ajudar a desenvolver estratégias e métodos educacionais mais eficazes de prevenção do abuso de drogas.

Décimo, pode ser usado para medicina personalizada.

Ao estudar as diferenças na resposta do sistema opióide em diferentes indivíduos em modelos animais, pode fornecer uma base teórica para o tratamento individualizado da dor e a gestão da dependência.

Tomadas em conjunto, espera-se que estas aplicações potenciais não só avancem na investigação básica em neurociência, mas também possam ter um impacto significativo na medicina clínica, no desenvolvimento de medicamentos e nas políticas de saúde pública.

É claro que serão necessários muitos anos de investigação e verificação para passar da investigação básica às aplicações práticas.

E no futuro:

Primeiro, o desempenho das sondas existentes será melhorado.

Isto é, melhorando a especificidade, sensibilidade, faixa dinâmica e propriedades cinéticas das sondas neuropeptídicas existentes.

Isto pode envolver estratégias de engenharia de proteínas mais complexas, tais como evolução dirigida assistida por IA, design racional guiado pela biologia estrutural, etc.

Em segundo lugar, serão desenvolvidas sondas fluorescentes visando mais neuropeptídeos.

Ou seja, estender a experiência existente a outros sistemas neuropeptídicos, neurotransmissores e neuromoduladores.

Terceiro, combine as sondas existentes com outras técnicas de imagem.

Por exemplo, espera-se que a combinação de sondas de neuropeptídeos com microscopia de super-resolução ou microscopia miniaturizada de dois fótons permita que as pessoas observem a dinâmica de liberação de neuropeptídeos no nível subcelular ou em animais que se movem livremente.

Ao mesmo tempo, com a ajuda da tecnologia de imagem multicolorida, as pessoas poderão observar a dinâmica de múltiplos neuropeptídeos ou neurotransmissores simultaneamente, revelando assim as interações entre eles.

Finalmente, a aplicação destas sondas não se limita à investigação básica, mas também tem potencial para se estender ao campo do desenvolvimento de medicamentos, ou seja, para desenvolver plataformas de rastreio de alto rendimento para ajudar a descobrir novos medicamentos neuropsiquiátricos.

Para sondas neuropeptídicas, também continuará a promover o desenvolvimento de pesquisas em neurociência em direção a maior resolução espaço-temporal, maior diversidade molecular e paradigmas comportamentais mais complexos, fornecendo suporte para a compreensão da função cerebral e o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento.

Referências:

1. Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y. et al. Desbloqueando a dinâmica do neuropeptídeo opioide com biossensores codificados geneticamente. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

Operação/composição: He Chenlong

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