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Kürzlich hat Dong Chunyang, ein direkter Doktorand der University of California, Davis und derzeit als Postdoktorand an der Stanford University forschend, gemeinsam eine neue genetisch kodierte Fluoreszenzsonde entwickelt, die ein innovatives Werkzeug für die Untersuchung der Neuropeptiddynamik darstellt.

Bild |. Dong Chunyang (Quelle: Dong Chunyang)

Berichten zufolgeDie Kernidee dieser Studie besteht darin, fluoreszierende Proteine ​​mit Opioidrezeptoren zu fusionieren und den Bindungsprozess von Opioidpeptiden in Echtzeit durch Änderungen der Fluoreszenzsignale widerzuspiegeln, die durch Änderungen in der Rezeptorkonformation verursacht werden.

Während dieser Zeit entwickelten Dong Chunyang und andere entsprechende Fluoreszenzsonden κLight, δLight und μLight für die drei wichtigsten Opioidrezeptor-Subtypen – κ-Rezeptor, δ-Rezeptor und μ-Rezeptor.

Auf diese Weise können nicht nur verschiedene Arten von Opioidpeptiden unterschieden werden, sondern auch eine Signaldetektion mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung auf Einzelzellebene erreicht werden.

(Quelle: Nature Neuroscience)

Durch die Entwicklung und Anwendung neuer Fluoreszenzsonden zielt diese Studie darauf ab, die Funktionen und Regulierungsmechanismen des Opioidpeptidsystems auf mehreren Ebenen eingehend zu untersuchen.

Dies wird nicht nur dazu beitragen, die Rolle des Opioidsystems im emotionalen und motivierenden Verhalten zu verstehen, sondern kann auch neue Erkenntnisse zum Verständnis und zur Behandlung damit verbundener psychischer Erkrankungen liefern.

Durch die Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen auf molekularer Ebene, der Signalübertragung auf zellulärer und Schaltkreisebene sowie der funktionellen Regulierung auf der gesamten Verhaltensebene wird erwartet, dass diese Errungenschaft revolutionäre Fortschritte bei der Erforschung des Opioidsystems bringen wird.

Es ist ein wichtiger Schritt hin zu einem besseren Verständnis des endogenen Opioidsystems und bietet ein wertvolles neues Werkzeug für die Untersuchung des Opioidpeptidsystems.

Sonden für endogene und synthetische Opioide sind eine großartige Ergänzung des aktuellen „Werkzeugkastens“ der Neurowissenschaften und können zu einer besseren räumlich-zeitlichen Erfassung der Opioidsignalisierung führen.

Dies wird nicht nur die Entwicklung der Grundlagenforschung in den Neurowissenschaften vorantreiben, sondern auch neue Perspektiven für klinische Anwendungen wie Schmerztherapie und Suchtbehandlung eröffnen.

(Quelle: Nature Neuroscience)

Beginnen wir mit dem „Status“ der Opioid-Neuropeptide

Berichten zufolge nimmt das Opioid-Neuropeptidsystem auf dem Gebiet der Neurowissenschaften eine zentrale Stellung ein.

Als wichtige neuromodulatorische Substanz spielen Opioidpeptide eine unverzichtbare Rolle bei der Regulierung zahlreicher physiologischer und pathologischer Prozesse wie Schmerzwahrnehmung, Belohnungsverhalten, emotionale Reaktion und Sucht.

Eine eingehende Erforschung des endogenen Opioidpeptidsystems war jedoch lange Zeit durch technische Mittel begrenzt.

Obwohl traditionelle Forschungsmethoden wie Immunhistochemie und Radioligandenbindungsexperimente statische Informationen zur Verteilung von Opioidpeptiden liefern können, ist es schwierig, den dynamischen Freisetzungsprozess und das feine räumlich-zeitliche Verteilungsmuster von Opioidpeptiden im lebenden Nervensystem zu erfassen.

Insbesondere bei der Erforschung der Funktion von Opioidpeptiden in bestimmten neuronalen Schaltkreisen und der Erforschung der dynamischen Veränderungen der Opioidpeptidfreisetzung unter komplexen Verhaltenszuständen reichen die vorhandenen Technologien oft nicht aus.

Um die oben genannten Engpässe zu überwinden, entwickelten Dong Chunyang und seine Mitarbeiter diese Strategie für fluoreszierende Sonden für Opioidrezeptoren, die auf genetischer Kodierung basiert.

Zuvor hatte Dong Chunyangs Doktorvater eine Calciumionensonde GCaMP3 entwickelt, die mithilfe von Fluoreszenz die Gehirnnervenaktivität bei mehreren Arten analysieren kann und damit einen wichtigen Beitrag zur Erkennung neuronaler Aktivität mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung leistet.

Es legte auch einen gewissen Grundstein für die Optimierung von Calciumionensonden. Derzeit wird die GCaMP-Serie von Calciumionensonden im Bereich der Neurowissenschaften häufig eingesetzt.

Die oben genannten Leistungen des Ausbilders Dong Chunyang legten den Grundstein für die Entwicklung neuer Neurotransmitter-Sonden.

Unter der Leitung seines Mentors beteiligte sich Dong Chunyang in den letzten Jahren an der Untersuchung rotverschobener Dopaminsonden und entwickelte zwei Serotoninsonden und verschiedene andere Neuropeptidsonden.

Gleichzeitig arbeitete Dong Chunyang auch mit dem Team von Professor Li Yulong von der Peking-Universität zusammen, um einen Übersichtsartikel über die Entwicklung und Anwendung von Neurotransmitter-Sonden zu veröffentlichen. Diese Erfahrungen verschafften ihm Einblicke in die Erforschung komplexerer Opioidpeptidsonden.

Auf dieser Grundlage erkannte Dong Chunyang, dass die Entwicklung von Opioid-Peptidsonden größere Herausforderungen mit sich brachte als zuvor entwickelte Neurotransmitter-Sonden.

Die Komplexität des Opioidpeptidsystems, das mehrere endogene Opioidpeptide und mehrere Rezeptorsubtypen umfasst, macht es besonders schwierig, hochspezifische Sonden zu entwickeln.

Und im Gegensatz zu anderen Sonden gibt es für die Entwicklung von Opioidpeptidsonden keine vorgefertigte Formel, der man folgen kann. Dies bedeutet, dass jede Sondenvariante einzeln entworfen und verifiziert werden muss, was den Arbeitsaufwand und die Komplexität erheblich erhöht.

Beispielsweise ist es notwendig, die optimale Insertionsstelle und Verbindungssequenz für fluoreszierende Proteine ​​zu finden und gleichzeitig die Rezeptorfunktion aufrechtzuerhalten. In dieser Zeit war eine Menge molekularbiologischer Arbeit erforderlich, einschließlich der Entwicklung, Konstruktion und Prüfung Hunderter verschiedener Varianten.

Während der In-vitro-Charakterisierungsphase muss jede Sondenvariante sorgfältig auf ihre Reaktion auf verschiedene Opioidpeptide und Rezeptorsubtypen untersucht werden. Inklusive detaillierter Bestimmung des Dynamikbereichs, der Empfindlichkeit, der Selektivität und der Reaktionskinetik der Sonde.

Durch eine große Anzahl von In-vitro-Charakterisierungsexperimenten haben Dong Chunyang und andere Varianten mit größerem Dynamikbereich, höherer Empfindlichkeit und höherer Spezifität herausgesucht.

Anschließend führten sie Überprüfungsarbeiten zur Spezifität der Sonde durch und nutzten die optogenetische Stimulation des BLA-NAc-Schaltkreises in Experimenten zwischen Dynorphin-Knockout-Mäusen und Wildtyp-Mäusen, um die Spezifität von κLight für Dynorphin-Sex zu beweisen.

Dies stellt nicht nur sicher, dass die Sonde in komplexen neuronalen Umgebungen weiterhin Spezifität und Empfindlichkeit beibehält, sondern stellt auch die Zuverlässigkeit der Sonde sicher, wenn Benutzer sie unter physiologischen Bedingungen verwenden.

(Quelle: Nature Neuroscience)

Unzählige Wiederholungen, Misserfolge, Optimierungen und Wiederholungen

Dong Chunyang sagte, dass eines der Ziele dieser Forschung darin bestehe, die pharmakologischen Eigenschaften dieser neuen Sonden in vitro und in isolierten Hirnschnitten umfassend zu charakterisieren.

Dazu gehört die Bestimmung der Affinität, Selektivität und kinetischen Eigenschaften der Sonden für verschiedene endogene und synthetische Opioidpeptide.

Nach einem Vergleich mit herkömmlichen Radioliganden-Bindungsexperimenten hoffen sie zu überprüfen, ob diese Sonden die Wechselwirkung von Opioidpeptiden mit Rezeptoren genau widerspiegeln.

Gleichzeitig muss auch beurteilt werden, ob die Expression der Sonde die normale Funktion endogener Opioidrezeptoren beeinflusst, um ihren Einsatzwert unter physiologischen Bedingungen sicherzustellen.

Das zweite Ziel dieser Studie besteht darin, mit diesen Sonden die Diffusionseigenschaften von Opioidpeptiden im Hirngewebe zu untersuchen.

Bisher wurde angenommen, dass Opioidpeptide hauptsächlich durch volumetrischen Transport wirken. Direkte Belege für das konkrete Ausmaß und die Geschwindigkeit der Verbreitung fehlen jedoch noch.

Zu diesem Zweck entwarf die Forschungsgruppe ein ausgeklügeltes Photolyseexperiment, um gleichzeitig Änderungen in Fluoreszenzsignalen durch Freisetzung lichtempfindlicher Opioidpeptidvorläufer zu überwachen und so erstmals eine Echtzeitbeobachtung und quantitative Analyse des Diffusionsprozesses von Opioidpeptiden zu erreichen.

Durch dieses ExperimentSie enthüllten nicht nur die Diffusionskonstante von Opioidpeptiden, sondern lieferten auch eine wichtige Grundlage für das Verständnis der räumlichen Ausdehnung von Opioidpeptidsignalen.

Das dritte Ziel dieser Studie bestand darin, die optimalen elektrischen Stimulationsparameter zu bestimmen, die die Freisetzung endogener Opioidpeptide auslösen, was für die Untersuchung der Funktion von Opioidpeptiden in vivo von entscheidender Bedeutung ist.

Durch die systematische Anpassung der Stimulationsintensität, Stimulationsfrequenz und Stimulationsdauer in Hirnschnitten sowie die Überwachung der Reaktion von Fluoreszenzsonden hofft das Team, den effektivsten Stimulationsmodus zu finden und so eine gewisse Grundlage für elektrophysiologische Experimente und optogenetische Experimente zu legen.

In Tierversuchen kombinierten sie diese Fluoreszenzsonden mit optogenetischen Techniken, um die Dynamik der Freisetzung von Opioidpeptiden in bestimmten neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen.

Durch die Expression einer κLichtsonde im Nucleus accumbens und eines lichtempfindlichen Ionenkanals in der Amygdala kann beispielsweise die Aktivierung spezifischer Projektionen präzise gesteuert und die daraus resultierende endogene Dynorphinfreisetzung in Echtzeit beobachtet werden.

Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er nicht nur eine beispiellose zeitliche und räumliche Auflösung bietet, sondern auch die räumliche Spezifität der Freisetzung von Opioidpeptiden offenlegt.

Darüber hinaus führte das Forschungsteam auch die folgenden Untersuchungen durch: Erforschung der dynamischen Veränderungen der Opioidpeptidfreisetzung unter komplexen Verhaltenszuständen, beispielsweise während der Angstkonditionierung und beim Belohnungslernen.

Durch die Durchführung einer faseroptischen Photometrie bei sich frei bewegenden Tieren verwendeten Dong Chunyang und andere Sonden, um Veränderungen in Opioidpeptidsignalen im Zusammenhang mit bestimmten Verhaltensweisen zu erfassen.

Er erinnert sich noch an das erste Mal, als es ihm gelang, den Moment der Freisetzung endogener Opioidpeptide in lebenden Mäusen festzuhalten. „Wir haben mehrere Jahre damit verbracht, die Sonde zu optimieren und schließlich in vitro eine Variante bestätigt, die voraussichtlich erfolgreich in vivo eingesetzt werden wird“, sagte er.

Konkret verpackten sie das κLight-Plasmid in ein Adeno-assoziiertes Virus. Nachdem sie sich mit den Koordinaten des Gehirnbereichs der Maus vertraut gemacht hatten, begannen sie mit der intrakraniellen Injektion des Virus und warteten dann darauf, dass die Sonde im Gehirn der Maus exprimiert wurde.

„Nach unzähligen Wiederholungen, Misserfolgen, Optimierungen und Wiederholungen, als ich die κLight-Sonde auf dem Lichtaufzeichnungs-Computerbildschirm sah, während die Angstkonditionierungsstimulation voranschritt, begannen nacheinander helle Signalspitzen zu erscheinen, was mich wirklich bewegte.“ sagte.

Die wissenschaftliche Rationalität zog ihn jedoch schnell zurück und er musste beweisen, dass es sich bei dem, was er sah, um das von κLight erkannte Signal von Dynorphin handelte und nicht um andere Artefakte.

Nachdem die Reproduzierbarkeit des oben genannten Phänomens durch mehrere Mäuse nachgewiesen wurde, entwarf das Forschungsteam verschiedene Experimente, insbesondere optogenetische Experimente mit Dynorphin-Knockout-Mäusen, um zu beweisen, dass das Forschungsteam in Abwesenheit von Dynorphin und bei gleicher Stimulation kein Signal von der Nadel erscheint. Dadurch wird die Genauigkeit und Spezifität der Sonde demonstriert.

Als schließlich jedes Experiment auf ein Ergebnis mit starker Spezifität und hohem Signal-Rausch-Verhältnis hinwies, ließen alle endlich ihre Spannung los.

(Quelle: Nature Neuroscience)

Schließlich wurde der entsprechende Artikel in Nature Neuroscience (IF 21.2) mit dem Titel „Unlocking opioid neuropeptidedynamics with genericly encoded biosensors“ veröffentlicht.

Abbildung |. Verwandte Artikel (Quelle: Nature Neuroscience)

Dong Chunyang und Raajaram Gowrishankar von der University of Washington sind Co-Autoren.

Als Mitautoren fungieren Professor Michael R. Bruchas von der University of Washington, Professor Matthew R. Banghart von der University of California, San Diego und Professor Tian Lin vom Max Planck Florida Neuroscience Institute.

Mit dieser Leistung gewann Dong Chunyang den Toni Shippenberg Young Investigator Award der National Institutes of Health.

Zu den Bewerbungsaussichten:

Erstens kann es in der neurowissenschaftlichen Grundlagenforschung eingesetzt werden.

Die diesmal entwickelte Opioidrezeptor-Fluoreszenzsonde wird es den Menschen ermöglichen, die dynamischen Veränderungen von Opioidpeptiden im Nervensystem genauer zu beobachten und zu messen, und so dazu beitragen, die spezifische Rolle des Opioidsystems in verschiedenen neuronalen Prozessen aufzudecken, beispielsweise die Rolle von Lernen, Gedächtniseffekt, Emotionsregulierungseffekt usw.

Zweitens kann es zur Schmerzforschung eingesetzt werden.

Bei der Schmerzmodulation spielt das Opioidsystem eine Schlüsselrolle. Daher wird erwartet, dass diese Sonde dazu verwendet wird, die Freisetzungsmuster von Opioidpeptiden bei akuten und chronischen Schmerzzuständen zu untersuchen und so zur Entwicklung wirksamerer Strategien zur Schmerzbehandlung beizutragen.

Drittens können damit Suchtmechanismen untersucht werden.

Durch die Überwachung der Aktivität von Opioidpeptiden in Belohnungskreisen in Echtzeit können wir möglicherweise die neurobiologischen Grundlagen der Drogenabhängigkeit besser verstehen und Hinweise für die Entwicklung neuer Behandlungen liefern.

Viertens kann es für die Arzneimittelentwicklung und das Arzneimittelscreening verwendet werden.

Das heißt, diese Sonde kann für Hochdurchsatz-Screenings verwendet werden, um die Identifizierung neuer Opioidrezeptor-Modulatoren zu unterstützen und so zur Entwicklung sichererer und wirksamerer Analgetika beizutragen.

Fünftens kann es bei der Erforschung von Stimmungsstörungen eingesetzt werden.

Angesichts der engen Beziehung zwischen dem Opioidsystem und der Emotionsregulation wird erwartet, dass diese Sonde zur Untersuchung der neuronalen Mechanismen von Depressionen, Angstzuständen und anderen Stimmungsstörungen eingesetzt wird.

Sechstens kann es für Neuroimaging-Anwendungen verwendet werden.

Wenn diese Sonden modifiziert werden, werden sie voraussichtlich in nicht-invasiven bildgebenden Verfahren des Gehirns verwendet, um die Aktivität des Opioidsystems im menschlichen Gehirn zu beobachten.

Siebtens kann es zur Entwicklung der Neuromodulationstechnologie genutzt werden.

In Kombination mit Optogenetik oder chemischer Genetik sollen diese Sonden dazu beitragen, präzisere Neuromodulationstechniken zur Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Opioidsystem zu entwickeln.

Achtens kann es in der verhaltensneurowissenschaftlichen Forschung eingesetzt werden.

Das heißt, es wird verwendet, um die Rolle des Opioidsystems bei fortgeschrittenen kognitiven Funktionen wie komplexem Sozialverhalten und Entscheidungsfindung zu untersuchen.

Neuntens kann es zur Vorbeugung von Drogenmissbrauch eingesetzt werden.

Ein tieferes Verständnis der Funktion des Opioidsystems könnte dazu beitragen, wirksamere Strategien und Aufklärungsmethoden zur Drogenmissbrauchsprävention zu entwickeln.

Zehntens kann es für die personalisierte Medizin genutzt werden.

Durch die Untersuchung der Unterschiede in der Reaktion des Opioidsystems bei verschiedenen Personen in Tiermodellen kann eine theoretische Grundlage für eine individuelle Schmerzbehandlung und Suchtbehandlung geschaffen werden.

Zusammengenommen dürften diese potenziellen Anwendungen nicht nur die Grundlagenforschung in den Neurowissenschaften voranbringen, sondern möglicherweise auch erhebliche Auswirkungen auf die klinische Medizin, die Arzneimittelentwicklung und die öffentliche Gesundheitspolitik haben.

Natürlich werden viele Jahre der Forschung und Überprüfung erforderlich sein, um von der Grundlagenforschung zur praktischen Anwendung zu gelangen.

Und in Zukunft:

Erstens wird die Leistung bestehender Sonden verbessert.

Das heißt, die Spezifität, Empfindlichkeit, der dynamische Bereich und die kinetischen Eigenschaften bestehender Neuropeptidsonden werden verbessert.

Dies kann komplexere Protein-Engineering-Strategien umfassen, wie z. B. KI-gestützte gerichtete Evolution, rationales Design unter Anleitung der Strukturbiologie usw.

Zweitens werden fluoreszierende Sonden entwickelt, die auf mehr Neuropeptide abzielen.

Das heißt, die vorhandenen Erfahrungen auf andere Neuropeptidsysteme, Neurotransmitter und Neuromodulatoren auszuweiten.

Drittens: Kombinieren Sie vorhandene Sonden mit anderen bildgebenden Verfahren.

Beispielsweise wird erwartet, dass die Kombination von Neuropeptidsonden mit hochauflösender Mikroskopie oder miniaturisierter Zwei-Photonen-Mikroskopie es Menschen ermöglichen wird, die Freisetzungsdynamik von Neuropeptiden auf subzellulärer Ebene oder in sich frei bewegenden Tieren zu beobachten.

Gleichzeitig können Menschen mit Hilfe der mehrfarbigen Bildgebungstechnologie möglicherweise die Dynamik mehrerer Neuropeptide oder Neurotransmitter gleichzeitig beobachten und so die Wechselwirkungen zwischen ihnen aufdecken.

Schließlich beschränkt sich die Anwendung dieser Sonden nicht nur auf die Grundlagenforschung, sondern hat auch das Potenzial, sich auf den Bereich der Arzneimittelentwicklung auszudehnen, d. h. auf die Entwicklung von Hochdurchsatz-Screening-Plattformen, die bei der Entdeckung neuer neuropsychiatrischer Arzneimittel helfen sollen.

Bei Neuropeptidsonden wird es auch weiterhin die Entwicklung der neurowissenschaftlichen Forschung hin zu höherer räumlich-zeitlicher Auflösung, größerer molekularer Vielfalt und komplexeren Verhaltensparadigmen fördern und so das Verständnis der Gehirnfunktion und die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien unterstützen.

Referenzen:

1.Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y.et al. Entschlüsselung der Dynamik opioider Neuropeptide mit genetisch kodierten Biosensoren. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

Bedienung/Satz: He Chenlong

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