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최근 캘리포니아 대학교 데이비스에서 박사 학위를 취득하고 현재 스탠포드 대학교에서 박사후 연구를 진행 중인 Dong Chunyang은 신경펩타이드 역학 연구에 혁신적인 도구를 제공하는 새로운 유전자 암호화 형광 프로브를 공동 개발했습니다.

사진 | 동춘양 (출처: 동춘양)

보고서에 따르면,이번 연구의 핵심 아이디어는 형광 단백질을 오피오이드 수용체와 융합시키고, 수용체 형태의 변화에 ​​따른 형광 신호의 변화를 통해 오피오이드 펩타이드의 결합 과정을 실시간으로 반영하는 것이다.

이 기간 동안 Dong Chunyang과 다른 연구진은 세 가지 주요 오피오이드 수용체 하위 유형인 κ 수용체, δ 수용체 및 μ 수용체에 대해 각각 상응하는 형광 프로브 κLight, δLight 및 μLight를 설계했습니다.

이러한 방식으로 다양한 유형의 오피오이드 펩타이드를 구별할 수 있을 뿐만 아니라 단일 세포 수준에서 높은 시공간 분해능을 갖춘 신호 검출을 달성할 수 있습니다.

(출처: 네이처 신경과학)

새로운 형광 프로브의 개발과 적용을 통해 본 연구는 오피오이드 펩타이드 시스템의 기능과 조절 메커니즘을 여러 수준에서 심층적으로 탐구하는 것을 목표로 합니다.

이는 사람들이 정서적 및 동기 부여적 행동에서 오피오이드 시스템의 역할을 이해하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 관련 정신 질환을 이해하고 치료하는 데 대한 새로운 통찰력을 제공할 수도 있습니다.

분자 수준에서 수용체-리간드 상호 작용, 세포 및 회로 수준의 신호 전달, 전반적인 행동 수준의 기능 조절을 연구함으로써 이 성과는 오피오이드 시스템 연구에 혁명적인 진전을 가져올 것으로 예상됩니다.

이는 내인성 오피오이드 시스템에 대한 더 나은 이해를 향한 중요한 단계이며 오피오이드 펩타이드 시스템 연구를 위한 가치 있는 새로운 도구를 제공합니다.

내인성 및 합성 오피오이드에 대한 프로브는 현재의 신경과학 "도구 상자"에 큰 도움이 되며 오피오이드 신호의 더 나은 시공간 샘플링으로 이어질 수 있습니다.

이는 신경과학의 기초 연구 개발을 촉진할 뿐만 아니라 통증 관리 및 중독 치료와 같은 임상 적용에 대한 새로운 전망을 열어줄 것입니다.

(출처: 네이처 신경과학)

오피오이드 신경펩티드의 "상태"부터 시작해 보겠습니다.

보고에 따르면, 신경과학 분야에서는 오피오이드 신경펩타이드 시스템이 핵심적인 위치를 차지하고 있습니다.

주요 신경 조절 물질인 오피오이드 펩타이드는 통증 인식, 보상 행동, 정서적 반응 및 중독과 같은 여러 생리학적 및 병리학적 과정을 조절하는 데 없어서는 안 될 역할을 합니다.

그러나 내인성 오피오이드 펩타이드 시스템에 대한 심도 있는 연구는 오랫동안 기술적 수단에 의해 제한되어 왔습니다.

면역조직화학 및 방사성리간드 결합 실험과 같은 전통적인 연구 방법은 정적 오피오이드 펩타이드 분포 정보를 제공할 수 있지만 살아있는 신경계에서 오피오이드 펩타이드의 동적 방출 과정과 미세한 시공간 분포 패턴을 포착하기 어렵습니다.

특히 특정 신경 회로에서 오피오이드 펩타이드의 기능을 탐색하고 복잡한 행동 상태에서 오피오이드 펩타이드 방출의 동적 변화를 탐색할 때 기존 기술은 종종 부적절합니다.

위의 병목 현상을 극복하기 위해 Dong Chunyang과 그의 동료들은 유전자 코딩을 기반으로 하는 오피오이드 수용체 형광 프로브 전략을 개발했습니다.

이전에 동춘양의 박사 지도교수는 형광을 사용하여 여러 종의 뇌 신경 활동을 분석할 수 있는 칼슘 이온 프로브 GCaMP3를 개발하여 높은 공간적 및 시간적 해상도로 신경 활동을 탐지하는 데 중요한 기여를 했습니다.

이는 또한 칼슘 이온 프로브의 최적화를 위한 특정 토대를 마련했습니다. 현재 GCaMP 시리즈의 칼슘 이온 프로브는 신경과학 분야에서 널리 사용되고 있습니다.

동춘양 강사의 위와 같은 성과는 새로운 신경전달물질 탐침 개발의 초석을 마련했습니다.

동춘양은 멘토의 지도 하에 지난 몇 년간 적색편이 도파민 탐침 연구에 참여해 2개의 세로토닌 탐침과 기타 다양한 신경펩타이드 탐침을 개발했다.

동시에 Dong Chunyang은 Peking University의 Li Yulong 교수 팀과 협력하여 신경 전달 물질 프로브의 개발 및 응용에 관한 리뷰 논문을 발표했습니다. 이러한 경험을 통해 그는 더 복잡한 오피오이드 펩타이드 프로브를 탐색하는 데 대한 통찰력을 얻었습니다.

이를 바탕으로 동춘양은 오피오이드 펩타이드 프로브의 개발이 기존에 개발된 신경전달물질 프로브보다 더 큰 어려움에 직면해 있음을 깨달았습니다.

다수의 내인성 오피오이드 펩타이드와 다수의 수용체 아형을 포함하는 오피오이드 펩타이드 시스템의 복잡성으로 인해 고도로 특이적인 프로브를 개발하는 것이 특히 어렵습니다.

그리고 다른 프로브와 달리 오피오이드 펩타이드 프로브 개발을 위해 따라야 할 기성 공식이 없습니다. 즉, 각 프로브 변형을 개별적으로 설계하고 하나씩 검증해야 하므로 작업량과 복잡성이 크게 증가합니다.

예를 들어 수용체 기능을 유지하면서 최적의 형광단백질 삽입 부위와 연결 서열을 찾는 것이 필요하다. 이 기간 동안 수백 가지의 다양한 변종을 설계, 제작 및 선별하는 등 많은 분자생물학 작업이 이루어졌습니다.

시험관 내 특성화 단계에서 각 프로브 변이체는 다양한 오피오이드 펩타이드 및 수용체 하위 유형에 대한 반응을 신중하게 평가해야 합니다. 프로브의 동적 범위, 감도, 선택성 및 반응 동역학에 대한 자세한 결정을 포함합니다.

수많은 시험관 내 특성화 실험을 통해 Dong Chunyang 등은 더 큰 동적 범위, 더 높은 민감도 및 더 높은 특이성을 가진 변이체를 선별했습니다.

그 후 그들은 프로브의 특이성에 대한 검증 작업을 수행하고 디노르핀 녹아웃 마우스와 야생형 마우스 사이의 실험에서 BLA-NAc 회로의 광유전학적 자극을 사용하여 디노르핀 섹스에 대한 κLight의 특이성을 입증했습니다.

이를 통해 프로브가 복잡한 신경 환경에서 특이성과 감도를 유지할 수 있을 뿐만 아니라 사용자가 생리학적 조건에서 프로브를 사용할 때 프로브의 신뢰성도 보장됩니다.

(출처: 네이처 신경과학)

수많은 반복, 실패, 최적화 및 반복

Dong Chunyang은 이 연구의 목표 중 하나는 시험관 내 및 분리된 뇌 절편에서 이러한 새로운 프로브의 약리학적 특성을 포괄적으로 특성화하는 것이라고 말했습니다.

여기에는 다양한 내인성 및 합성 오피오이드 펩타이드에 대한 프로브의 친화성, 선택성 및 동역학 특성을 결정하는 것이 포함됩니다.

이를 전통적인 방사성 리간드 결합 실험과 비교한 후, 그들은 이러한 프로브가 오피오이드 펩타이드와 수용체의 상호 작용을 정확하게 반영하는지 확인하기를 희망합니다.

동시에, 프로브의 발현이 내인성 오피오이드 수용체의 정상적인 기능에 영향을 미치는지 여부를 평가하여 생리학적 조건 하에서의 적용 가치를 보장하는 것도 필요합니다.

이 연구의 두 번째 목표는 이러한 프로브를 사용하여 뇌 조직에서 오피오이드 펩타이드의 확산 특성을 탐색하는 것입니다.

이전에는 오피오이드 펩타이드가 주로 체적 수송을 통해 작용한다고 믿어졌습니다. 그러나 구체적인 확산 정도와 속도에 대한 직접적인 증거는 아직 부족합니다.

이를 위해 연구팀은 감광성 오피오이드 펩타이드 전구체를 방출해 형광 신호의 변화를 동시에 모니터링하는 독창적인 광분해 실험을 설계해 오피오이드 펩타이드의 확산 과정을 최초로 실시간 관찰 및 정량 분석할 수 있게 됐다.

이번 실험을 통해,그들은 오피오이드 펩타이드의 확산 상수를 밝혀냈을 뿐만 아니라 오피오이드 펩타이드 신호의 공간적 범위를 이해하는 데 중요한 기초를 제공했습니다.

이 연구의 세 번째 목표는 생체 내에서 오피오이드 펩타이드의 기능을 연구하는 데 중요한 내인성 오피오이드 펩타이드의 방출을 유발하는 최적의 전기 자극 매개변수를 결정하는 것이었습니다.

연구팀은 뇌 절편의 자극 강도, 자극 빈도 및 자극 지속 시간을 체계적으로 조정하고 형광 프로브의 반응을 모니터링함으로써 가장 효과적인 자극 모드를 찾아 전기생리학 실험과 광유전학 실험을 위한 확실한 기반을 마련할 수 있기를 바라고 있습니다.

살아있는 동물 실험에서 그들은 특정 신경 회로에서 오피오이드 펩타이드 방출의 역학을 탐구하기 위해 이러한 형광 프로브를 광유전학 기술과 결합했습니다.

예를 들어 측좌핵의 κLight 프로브와 편도체의 감광성 이온 채널을 표현함으로써 특정 돌기의 활성화를 정밀하게 제어할 수 있으며 결과적인 내인성 다이노르핀 방출을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

이 접근법의 이점은 전례 없는 시간적, 공간적 분해능을 제공할 뿐만 아니라 오피오이드 펩타이드 방출의 공간적 특이성을 드러낸다는 것입니다.

또한 연구팀은 두려움 조절 및 보상 학습과 같은 복잡한 행동 상태에서 오피오이드 펩타이드 방출의 동적 변화를 탐색하는 탐색도 수행했습니다.

자유롭게 움직이는 동물에서 광섬유 측광을 수행함으로써 Dong Chunyang과 다른 연구자들은 프로브를 사용하여 특정 행동과 관련된 오피오이드 펩타이드 신호의 변화를 포착했습니다.

그는 살아있는 쥐에서 내인성 오피오이드 펩타이드가 방출되는 순간을 처음으로 성공적으로 포착했던 때를 아직도 기억합니다. "우리는 프로브를 최적화하는 데 수년을 보냈고 마침내 생체 내에서 성공적으로 사용될 것으로 예상되는 시험관 내 변이체를 확인했습니다."라고 그는 말했습니다.

구체적으로, 그들은 κLight 플라스미드를 아데노 관련 바이러스에 포장했습니다. 마우스 뇌 영역의 좌표에 익숙해진 후 바이러스의 두개내 주입을 시작한 다음 프로브가 마우스 뇌에서 발현될 때까지 기다렸습니다.

“수없이 반복하고, 실패하고, 최적화하고, 반복한 끝에 공포 조건화 자극이 진행되면서 광기록 컴퓨터 화면에서 κLight 프로브를 보았을 때 밝은 신호 피크가 차례로 나타나기 시작했는데 정말 감동적이었습니다.” 말했다.

그러나 과학적 합리성은 그를 재빨리 뒤로 끌어당겼고, 그는 자신이 본 것이 다른 인공물이 아닌 κLight가 감지한 다이노르핀의 신호임을 ​​증명해야 했습니다.

연구팀은 여러 마리의 쥐를 통해 위 현상의 재현성을 입증한 후, 다양한 실험, 특히 다이노르핀이 없는 상태에서 동일한 자극을 가했을 때 바늘에서 신호가 나오지 않는다는 것을 증명하기 위해 다양한 실험, 특히 다이노르핀 녹아웃 마우스를 이용한 광유전학적 실험을 고안했다. 이를 통해 프로브의 정확성과 특이성을 입증합니다.

마지막으로 각 실험에서 특이성이 강하고 신호 대 잡음비가 높은 결과가 나왔을 때 모두가 마침내 긴장을 풀었습니다.

(출처: 네이처 신경과학)

마지막으로 관련 논문은 "Unlocking opioid Neuropeptide Dynamics with Genetically Encoded Biosensors"라는 제목으로 Nature Neuroscience(IF 21.2)에 게재되었습니다.

그림 | 관련 논문 (출처: Nature Neuroscience)

워싱턴 대학의 Dong Chunyang과 Raajaram Gowrishankar가 공동 저자입니다.

워싱턴 대학의 Michael R. Bruchas 교수, 샌디에이고 캘리포니아 대학의 Matthew R. Banghart 교수, Max Planck 플로리다 신경과학 연구소의 Tian Lin 교수가 공동 교신저자로 활동합니다.

이 성과로 동춘양은 국립보건원으로부터 토니 시펜버그 젊은 연구자상을 수상했다.

응용 전망 측면에서:

첫째, 기초 신경과학 연구에 활용될 수 있다.

이번에 개발된 오피오이드 수용체 형광 프로브는 사람들이 신경계에서 오피오이드 펩타이드의 역동적인 변화를 보다 정확하게 관찰하고 측정할 수 있게 함으로써, 다양한 신경 과정에서 오피오이드 시스템의 구체적인 역할을 밝히는 데 도움을 줄 것입니다. 학습, 기억효과, 감정조절 효과 등

둘째, 통증 연구에 활용될 수 있다.

통증 조절에서는 오피오이드 시스템이 중요한 역할을 합니다. 따라서 본 프로브는 급성 통증 상태와 만성 통증 상태에서 오피오이드 펩타이드의 방출 패턴을 연구하는데 활용되어 보다 효과적인 통증 관리 전략 개발에 도움이 될 것으로 기대됩니다.

셋째, 중독 메커니즘을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

보상 회로에서 오피오이드 펩타이드의 활동을 실시간으로 모니터링함으로써 약물 중독의 신경생물학적 기초를 더 잘 이해하고 새로운 치료법 개발을 위한 단서를 제공할 수 있습니다.

넷째, 신약개발 및 약물 스크리닝에 활용될 수 있다.

즉, 이 프로브는 새로운 오피오이드 수용체 조절제를 식별하는 데 도움이 되는 고처리량 스크리닝에 사용될 수 있으며 이를 통해 보다 안전하고 효과적인 진통제 개발에 도움이 될 수 있습니다.

다섯째, 기분장애 연구에 활용될 수 있다.

오피오이드 시스템과 감정 조절 사이의 밀접한 관계를 고려할 때, 이 프로브는 우울증, 불안과 같은 기분 장애의 신경 메커니즘을 연구하는 데 사용될 것으로 기대됩니다.

여섯째, 신경영상 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

이러한 탐침이 수정되면 인간 뇌의 오피오이드 시스템 활동을 관찰하기 위한 비침습적 뇌 영상 기술에 사용될 것으로 예상됩니다.

일곱째, 신경조절 기술 개발에 활용될 수 있다.

광유전학 또는 화학 유전학과 결합된 이러한 프로브는 오피오이드 시스템과 관련된 질병을 치료하기 위한 보다 정확한 신경 조절 기술을 개발하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

여덟째, 행동신경과학 연구에 활용될 수 있다.

즉, 복잡한 사회적 행동 및 의사결정과 같은 고급 인지 기능에서 오피오이드 시스템의 역할을 연구하는 데 사용됩니다.

아홉, 약물 남용을 예방하는 데 사용할 수 있습니다.

오피오이드 시스템의 기능에 대한 더 깊은 이해를 얻으면 보다 효과적인 약물 남용 예방 전략과 교육 방법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

열째, 개인맞춤의학에 활용될 수 있다.

동물 모델에서 다양한 개인의 오피오이드 시스템 반응의 차이를 연구함으로써 개별화된 통증 치료 및 중독 관리를 위한 이론적 기초를 제공할 수 있습니다.

종합해보면, 이러한 잠재적인 응용은 신경과학의 기초 연구를 발전시킬 뿐만 아니라 임상 의학, 약물 개발 및 공중 보건 정책에도 상당한 영향을 미칠 수 있을 것으로 예상됩니다.

물론, 기초 연구에서 실제 응용으로 나아가기까지는 수년간의 연구와 검증이 필요할 것입니다.

그리고 미래에는:

첫째, 기존 프로브의 성능이 향상된다.

즉, 기존 신경펩타이드 프로브의 특이성, 민감도, 동적 범위 및 동역학 특성을 향상시키는 것입니다.

여기에는 AI 지원 방향 진화, 구조 생물학에 따른 합리적 설계 등과 같은 보다 복잡한 단백질 공학 전략이 포함될 수 있습니다.

둘째, 더 많은 신경펩타이드를 표적으로 하는 형광 프로브가 개발될 것입니다.

즉, 기존 경험을 다른 신경펩티드 시스템, 신경전달물질 및 신경조절제로 확장하는 것입니다.

셋째, 기존 프로브를 다른 이미징 기술과 결합합니다.

예를 들어, 신경펩티드 프로브를 초고해상도 현미경이나 소형화된 2광자 현미경과 결합하면 사람들이 세포 이하 수준이나 자유롭게 움직이는 동물에서 신경펩티드의 방출 역학을 관찰할 수 있을 것으로 기대됩니다.

동시에 다색 이미징 기술의 도움으로 사람들은 여러 신경펩티드 또는 신경전달물질의 역학을 동시에 관찰하여 이들 사이의 상호 작용을 밝힐 수 있습니다.

마지막으로, 이러한 프로브의 적용은 기초 연구에만 국한되지 않고 약물 개발 분야, 즉 새로운 신경정신병 약물 발견에 도움이 되는 높은 처리량 스크리닝 플랫폼을 개발하는 데까지 확장될 가능성이 있습니다.

신경펩티드 프로브의 경우, 더 높은 시공간 해상도, 더 넓은 분자 다양성, 더 복잡한 행동 패러다임을 향한 신경과학 연구 개발을 계속 촉진하여 뇌 기능을 이해하고 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움을 줄 것입니다.

참고자료:

1. Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y. et al. 유전적으로 인코딩된 바이오센서로 오피오이드 신경펩타이드 역학을 잠금 해제. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

운영/조판: He Chenlong

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